[背景及目的]乙型肝炎病毒(HBV)引起的慢性感染是肝癌发生的主要危险因素。文献报道及我们前期研究证明HBV感染可诱导IL-23和IP-10的表达,且在HBV感染的病人血清以及组织中呈高表达。已有报道表明某些细胞因子,如IL-23能促进细胞的增殖以及侵袭转移等,发挥着促肿瘤的作用；IL-23及IP-10等细胞因子亦能促进T细胞的浸润,发挥免疫应答功能,抑制肿瘤生长。HNF4α是肝细胞分化因子,在肝脏、肾以及小肠的发生发展中发挥重要的作用。而HNF4α与炎症密切相关,是诸多细胞因子的靶分子,IL-1、IL-6及TNF等细胞因子对其表达以及活性均有影响。IL-23或IP-10是否在HBV感染引起的慢性炎症中影响HNF4α的表达,以及对肝癌细胞的生物学行为的影响及其作用机制仍不清楚。本研究旨在探讨HBV诱导IL-23、IP-10及其受体在不同肝细胞中的表达对肝癌细胞的生物学行为的影响及其机制,为以其为靶点的肿瘤干预策略提供实验依据。[方法]1. HepG2以及HepG2.215细胞系中细胞因子表达的检测HepG2和HepG2.215中细胞炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF、IL-23、HMGB1、 IL-17以及IL-33)的表达采用RT-PCR检测。2.不同肝细胞系中内质网应激分子GRP78、肝细胞分化相关分子HNF4α以及HNF4α靶基因G6Pase表达的检测1)肝细胞系L02、HepG2、Huh-7以及]HepG2.215中GRP78、HNF4α和G6Pase mRNA水平的表达采用RT-PCR检测；2)肝细胞系LO2、HepG2、Huh-7以及HepG2.215中GRP78和HNF4α蛋白水平的表达采用Western Blot检测。3.肝癌细胞HBV瞬时转染后GRP78以及]HNF4α表达的检测1) HepG2瞬时转染HBV24h、48h以及72h后GRP78和HNF4a mRNA的表达采用RT-PCR检测；2) HepG2和Huh-7瞬时转染HBV72h后GRP78和HNF4a蛋白水平的表达采用Western Blot检测。4.检测IL-23受体(IL-23R)以及IP-10受体(CXCR3)在肝癌细胞系中的表达1)肝癌细胞系HepG2、Huh-7和HepG2.215中IL-23R的表达采用RT-PCR检测;2) HepG2和HepG2.215细胞中IL-23R以及CXCR3的表达采用流式细胞术(FCM)检测;3) HepG2、Huh-7和HepG2.215细胞中IL-23R以及CXCR3的表达采用免疫荧光检测;5.肝癌组织标本中CXCR3的表达采用细胞免疫组化法(组织切片)检测6.细胞因子对肝癌细胞生物学影响实验1)细胞增殖实验：不同浓度IL-23或IP-10 (0ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml, 40ng/ml)刺激细胞48h后,CCK-8检测细胞增殖率；2)细胞周期实验：不同浓度IL-23或IP-10 (0ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml, 40ng/ml)刺激细胞24h后,固定过夜,PI染色后流式细胞术(FCM)检测细胞周期变化：3)细胞凋亡实验：无血清状况下加入不同浓度的IL-23或IP-10 (0ng/ml,5ng/ml, 1 Ong/ml,20ng/ml,40ng/ml)培养细胞48h, AnnexinV-FITC和P1染色,FCM检测细胞凋亡；4)细胞克隆实验：细胞接种至六孔板,IL-23 (0ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)或IP-10 (0ng/ml,10ng/ml,40ng/ml)培养细胞5～7天,结晶紫染色；5)细胞划痕实验：细胞单层铺满孔板,刮去部分细胞,加入不同浓度IL-23 (Ong/ml,20ng/ml,40ng/ml)或IP-10 (0ng/ml,10ng/ml,40ng/ml)培养,观察划痕处细胞生长情况；6)细胞趋化侵袭实验：用Transwell法检测不同浓度的IP-10 (0ng/ml,10ng/ml, 20ng/ml,40ng/ml)处理后肝癌细胞的趋化能力；采用Transwell检测不同浓度IL-23或IP-10 (0ng/ml,5ng/ml,1 Ong/ml,20ng/ml,40ng/ml)处理后肝癌细胞的侵袭能力；7.IL-23或IP-10作用于肝癌细胞系后HNF4a表达的检测1)不同比例的HepG2.215上清加或不加IP-10抗体(0μg/ml,0.5μ/ml,1μg/ml, 2μg/ml,4μg/ml)培养肝癌细胞24h后,HepG2细胞中HNF4α的表达采用用Western Blot检测；2)不同浓度IL-23或IP-10 (0ng/ml,5ng/ml,10ng/m,20ng/ml,40ng/ml)处理24h后,肝癌细胞系中HNF4α的表达采用Western Blot检测。8.IL-23或IP-10作用于肝癌细胞系后相关基因及CD133表达的检测1)不同浓度IL-23或IP-10 (0ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)处理24h后肝癌细胞系中相关基因的表达采用Realtime PCR检测；2)不同浓度IL-23或IP-10 (0ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)处理24h后肝癌细胞系中CD133的表达采用流式细胞术(FCM)检测。9.肝癌细胞中细胞因子及其配体信号激活通路的检测不同浓度IL-23或IP-10 (0ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml)刺激肝癌细胞24h后,STAT3蛋白的磷酸化形式p-STAT3、AKT蛋白的磷酸化形式p-AKT、HNF4α、E-cadherin以及GRP78的表达采用Western Blot检测。[结果]1.肝癌细胞系及组织中细胞因子及其受体的表达：肝癌细胞系HepG2中所检测的细胞因子低表达,HBV稳定转染的肝癌细胞系HepG2.215中炎性因子TN、IL-23、HMGB1以及IL-1β表达增加,以IL-23的表达增加最为明显；肝癌细胞系中均具有IL-23R以及CXCR3的表达；2.不同肝细胞系中HNF4α、GRP78以及G6Pase的表达：实验结果表明,肝癌细胞系中均有HNF4α、GRP78以及G6Pase mRNA的表达,并且在HBV稳定转染肝癌细胞系HepG2.215中其表达则降低；HepG2.215细胞中GRP78蛋白的表达亦降低,HNF4α蛋白的表达明显降低；肝癌细胞瞬时转染HBV 24h、48h以及72h时GRP78和HNF4α的表达：结果表明瞬时转染HBV 24h、48h以及72h后,GRP78和HNF4α mRNA的表达变化不明显,而HBV瞬转72h后,GRP78蛋白水平的表达降低,HNF4α蛋白水平的表达显著降低；3.IL-23对肝癌细胞生物学行为的影响：结果表明,在一定浓度范围内随着浓度的升高IL-23促进细胞增殖、细胞S期阻滞、细胞修复、细胞克隆形成以及侵袭转移,减少细胞凋亡,当浓度达到40ng/ml时,其作用逐渐减弱;4.IP-10对肝癌细胞生物学行为的影响：在一定浓度范围内随着浓度的升高IP-10亦能促进细胞增殖和细胞S期阻滞,减少细胞凋亡;细胞修复、细胞克隆形成、细胞趋化以及侵袭转移能力增强,且具有一定的浓度依赖性；但当浓度达到40ng/ml时,其作用减弱；5.IL-23对HNF4α、GRP78、Bcl-2、CD 133以及MMP9表达的影响：在一定的浓度范围内,随着IL-23浓度的升高,]HTF4α蛋白表达降低,GRP78蛋白表达增加但没有统计学差异；抗凋亡基因Bcl-2、干细胞化标志CD133以及侵袭相关基因MMP9等mRNA表达上调；在20ng/ml时这种作用最为明显,40ng/ml时其上调作用下降；6.IP-10对HNF4α、GRP78、Bcl-2、CD133以及MMP9表达的影响：在一定的浓度范围内,随着IP-10浓度升高,]ANF4α的蛋白表达降低,但对GRP78的表达具有促进作用,在40ng/ml时其促进作用较为明显;抗凋亡基因BCL-2、干细胞标志CD133以及侵袭相关基因MMP9等mRNA表达上调,在lOng/ml时这种作用最为明显,40ng/ml时其作用降低。7.不同浓度IL-23和IP-10对STAT3以及AKT活化的影响不同,IL-23在一定浓度范围内,促进STAT3活化,随着浓度升高,对STAT3活化的促进作用减弱,5ng/ml时促进作用最为明显,而40ng/ml时对其活性具有一定的抑制作用；IL-23对E-cadherin的表达具有一定的抑制作用,随着IL-23浓度的升高E-cadherin的表达降低;IP-10在一定的浓度范围内促进AKT活化,10ng/ml时最为明显,随着浓度的进一步升高,AKT活化降低；IP-10在一定的浓度范围内对E-cadherin的表达具有抑制作用,10ng/ml时抑制作用最为明显。[结论]本研究结果表明：①HBV可诱导炎性因子IP-10以及IL-23表达,抑制HNF4a和GRP78的表达,IL-23R以及IP-10的受体(CXCR3)在肝癌细胞中均有表达,提示IL-23和IP-10分别可与肝癌细胞系表面相应受体结合从而发挥不同的生物学效应;②证明在一定的浓度范围内,随着浓度的升高,IL-23和IP-10促进细胞增殖、细胞修复、细胞克隆形成以及侵袭转移,同时也能上调BCL-2、CD133以及MMP9等相关基因的表达,降低HNF4α的表达,提示IL-23以及IP-10具有促进肝癌的作用,其作用可能与HF4α的表达降低有关；③IL-23在一定浓度范围内,促进STAT3活化,具有浓度依赖性,并抑制INF4α以及E-cadherin的表达；④IP-10在一定的浓度范围内促进AKT活化,lOng/ml时最为明显；IP-10在一定的浓度范围内对E-cadherin的表达具有抑制作用。研究结果表明,在一定的浓度范围内IL-23以及IP-10对肿瘤的发生具有促进作用,提示其对肝癌细胞生物学行为的影响与HNF4α表达的降低以及STAT3和AKT的活化相关,为肝癌发生发展的机制研究提供了线索。