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能源是一个国家正常运转的内在动力,直接关系到社会的稳定和发展,影响着国家的经济命脉和安全,同时也影响着生态环境的保护、开发与利用。植物源生物质具有分布广、可再生、储量大的特点,被视为是一种可以替代化石能源的新型碳能源和可再生资源。目前,人们对植物生物质资源的利用已经有了丰硕的成果,但是由于植物源生物质种类的多样性以及结构的精密性和复杂性,导致了植物生物质的利用还存在许多障碍。近年来研究人员在生物质降解方面发现了一类新的纤维素降解酶系——依赖铜离子的多糖单加氧酶（Polysaccharide monooxygenases,PMOs）,可以氧化裂解包括纤维素在内的高分子物质,为植物生物质的高效利用提供了新的思路。PMO是近年来研究较为广泛的一类酶,是首次发现的可以依赖铜离子进行催化的氧化酶。该酶广泛分布于具有纤维素降解能力的真菌、细菌以及病毒中。该酶一经发现,由于其具有较低的纤维素降解活性,在很长时间内都将其归类为糖苷水解酶61家族（GH61）和碳水化合物结合模块33家族（CBM33）家族。2013年对这两个家族的酶进行了新的分类,将其划分至辅助活性酶类,分别归类为AA9家族和AA10家族。目前共发现8个家族的PMO。PMO是一类在还原剂存在的条件下,通过在不同碳位加氧引起羟基化作用,造成糖苷键断裂的铜离子依赖酶。由于PMO这种特殊的断键机制,降低了从高度结晶纤维素上分离纤维素链的难度,从而提高了纤维素酶的降解效率。PMO同样在植物病理学研究中起着至关重要的作用,作为一种细胞壁降解酶,其可以在植物病原微生物侵染植物时氧化裂解细胞壁,消除植物防卫屏障,加速病原微生物的入侵,也可以作为效应子参与病原微生物的致病过程或引起寄主植物的免疫防卫反应,此外,在不同物种之间的共生过程中,PMO也可以参与物种间的营养转运和信息传递等过程。为了探究PMO的酶解特性及其在动物消化道内的生物学功能,本研究以嗜热革节孢AA9家族的PMO酶HiPMO1为研究对象,深入研究了该酶的活性、氧化方式、产物组成成分以及和纤维素酶的协同作用;明确了马消化道中存在纤维素的氧化降解;探索了嗜热真菌AA9家族PMO在马消化道中的生物学功能,对马消化道中嗜热真菌的定殖、AA9家族PMO蛋白的表达以及产物的组成做了分析和鉴定。结果如下:利用真核表达技术获得HiPMO1酶,将HiPMO1酶和不溶性底物磷酸膨胀纤维素（PASC）在p H 5.0、50℃及还原剂存在条件下反应48 h。薄层层析（TLC）检测结果显示HiPMO1酶对不溶性底物PASC具有活性,且随着反应时间的不断推移,产物量也在不断增加,产物主要由纤维二糖至纤维五糖构成。对产物进行甲基化处理,基质辅助激光解析电离飞行质谱（MALDI-TOF-MS）分析甲基化处理后的样品显示,反应产物中存在以C1氧化型和C4氧化型为主的纤维寡糖。为了进一步分析酶解产物的组成成分,首先将酶解产物经三氟乙酸（TFA）水解,利用高效液相色谱-示差折光检测法（HPLC-RID）分析,证明了反应产物中存在C1氧化产物;再利用硼氢化钠对酶解产物进行还原反应,再进行TFA水解,利用HPLC-RID分析也证明了产物中存在C4氧化产物。此外,我们还初步分析了HiPMO1酶和纤维素酶之间的协同作用。利用HiPMO1酶预处理PASC,再用三种纤维素酶（EGII、CBHI、BGLI）分别对底物进行酶解,利用DNS法检测反应结束后产生的还原糖产量,结果显示还原糖产量分别增加了1.35倍、1.49倍和1.33倍;而以CMC-Na为底物时,还原糖产量分别增加了0.24倍、0.36倍和0.55倍。综上所述,HiPMO1酶在氧化裂解纤维素时存在C1和C4两种氧化方式,并且底物和纤维素酶种类的不同也会影响HiPMO1酶的协同作用。为了探究嗜热真菌AA9家族PMO在动物消化道内的生物学功能。首先对马粪和马胃食糜中不溶性纤维素进行了分离提取,用内切-1,4-β-D-纤维素酶对不溶性纤维素进行酶解反应,对酶解产物分别用MALDI-TOF-MS、LC-MS（液相色谱质谱联用）、HPAEC-PAD（高效液相离子色谱安培检测器）和HPLC-RID进行分析。结果表明马粪和马胃不溶性纤维素中都存在C1氧化型纤维素。利用乙醇对马胃食糜中可溶性纤维寡糖进行分离提取,利用MALDI-TOF-MS和HPLC-RID对提取物进行分析,结果显示可溶性纤维寡糖中存在C1和C4氧化型寡糖。以上结果都说明马的消化道中存在以C1和C4氧化型产物为主的纤维素氧化裂解现象。为明确马消化道中嗜热真菌的种类,我们成功从马胃食糜中分离了三种嗜热真菌并鉴定其种类。内部转录间隔区（ITS）测序结果显示,三种嗜热真菌分别是嗜热革节孢（Scytalidium thermophilum）、嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum）和嗜热子囊菌（Thermoascus aurantiacus）。为了进一步验证三种嗜热真菌在马体温条件下的生长状况及其PMO基因的表达特征,将三种嗜热真菌转接至37℃纤维素培养基上,观察发现三种嗜热真菌均能正常生长,并且其AA9家族基因Hipmo1、Ctpmo1和Ta AA9A在此条件下均能正常表达。为了明确三种嗜热真菌AA9家族PMO基因在马胃中的表达特征,我们提取了马胃和马肠食糜的总RNA,利用PCR方法验证了两个AA9家族的PMO基因Ctpmo1、Ta AA9A可以在马胃和马肠中正常表达。结果证明三种嗜热真菌可以在马的消化道中定殖生长,并且其AA9家族的PMO基因可以正常表达。为了进一步明确马胃中PMO的种类及酶解特性,对马胃中的AA9家族PMO蛋白进行了提取,用DEAE-Sepharose阴离子交换层析法对蛋白进行分离纯化。利用LC-MS/MS（液相色谱串联质谱）对分离纯化的蛋白进行鉴定,结果显示存在6个嗜热真菌AA9家族PMO蛋白,其中3个来自太瑞斯梭孢壳霉（Thielavia terrestris）,而另外3个分别来自嗜热革节孢（S.thermophilum）、嗜热毛壳菌（C.thermophilum）和嗜热子囊菌（T.aurantiacus）。此外,在37℃下分别用HiPMO1、Ct PMO1和Ta AA9A处理PASC,利用MALDI-TOF-MS和HPLC-RID对酶解产物进行分析,结果显示三种酶均可以产生C1氧化产物。以上结果直接证明马消化道中存在嗜热真菌表达的AA9家族PMO酶,并且可以在马体温条件下氧化裂解纤维素。此外,我们还发现白蚁粪便不溶性纤维素中也存在C1和C4氧化纤维素,证明了白蚁的消化道中也存在纤维素的氧化裂解现象。综上所述,本研究首先明确了HiPMO1酶在氧化裂解纤维素时存在C1和C4两种氧化方式,验证了HiPMO1酶可以和纤维素酶在降解纤维素时产生协同作用;其次证明了马消化道中存在以C1和C4两种氧化方式为主的纤维素氧化裂解反应;最后明确了马消化道中存在嗜热真菌表达的AA9家族PMO蛋白,而且其可以在马体温条件下氧化裂解纤维素。本研究拓展了AA9家族PMO新的生物学功能,也阐明了动物消化道内嗜热真菌的生物学意义。