[背景和目的]假体植入乳房重建术是乳腺癌患者重要的整形手段,但术后包膜挛缩一直是难以解决的难题,其中假体植入过程中表皮葡萄球菌的污染成为术后包膜挛缩的主要因素,而细菌生物膜的形成是重要原因之一。表皮葡萄球菌生物膜的形成受众多基因的调控,微环境的改变或调节因子的紊乱会使其表达发生变化,在乙醇存在的条件下可在体外诱导其表达,人体内激素水平的改变也会导致体内细菌特性的改变。人体内性激素水平的升高,会导致特定位置的细菌数量和毒力增加,从而使宿主出现相关感染。乳腺癌是一种激素依赖型肿瘤,大量流行病学调查已证实乳腺癌患者体内雌激素水平较正常人群高,但对这类高雌激素水平的人群,其假体表面细菌生物膜形成能力的研究尚未见报道。雌激素与细菌生物膜形成、包膜挛缩之间相互作用的关系也尚不清楚。因此我们设想作为长期处于高雌激素水平的乳腺癌人群,是否她们的雌激素水平也会影响乳腺假体表面表皮葡萄球菌的生物学性状,最终在假体包膜挛缩的发生过程中起不良作用。本研究的目的:通过体外实验,观察雌二醇对定植在乳腺假体表面表皮葡萄球菌生长和生物膜形成的影响。检测雌二醇对表皮葡萄球菌aap、icaA、SarA、Lux、RNAⅢⅢ和icaR基因表达的影响。并建立乳腺硅胶材料表皮葡萄球菌感染动物模型,探讨雌二醇水平在机体内生物材料表面表皮葡萄球菌感染中的作用。第一部分:雌二醇对乳腺假体表面表皮葡萄球菌生物膜形成的影响[目的]观察不同雌二醇水平对假体表面表皮葡萄球菌生长、生物膜形成能力和生物膜结构的影响。[方法]模拟乳腺癌患者体内雌二醇水平,按照不同雌二醇浓度(0、50、125、250、500pmol/L)分为对照组和实验组;以乳房硅胶为载体,选用表皮葡萄球菌标准株(ATCC35984生物膜表型阳性、ATCC12228生物膜表型阴性)和临床株(SE101生物膜表型阳性、SE40生物膜表型阴性)作为研究对象孵育4h、6h、12h、24h、48h和72h。根据OD值绘制出生长曲线;用结晶紫染色半定量检测法评估生物膜初始黏附能力和形成能力。以前期实验数据为依据,选用表皮葡萄球菌标准株(ATCC35984和ATCC12228)为研究对象,运用二甲氧唑黄(XTT)比色法检测表皮葡萄球菌细菌生长动力,同时比较不同初始菌液浓度对生物膜形成过程的影响。在不同雌二醇浓度作用下,利用激光共聚焦显微镜(CLSM)测量ATCC35984在硅胶材料表面孵育6h、12h和24h后形成的生物膜厚度,并观察24h时生物膜的代谢状态。扫描电子显微镜(SEM)观察在不同雌二醇浓度下、不同时间点表皮葡萄球菌标准株和临床株细菌生物膜的超微结构。[结果]①细菌生长曲线:在无雌二醇作用的空白组中,ATCC35984、ATCC12228、SE101和SE40四株菌株都是在第4小时进入对数生长期。在125pmol/L雌二醇组中,四株表皮葡萄球菌都在第3小时就进入对数生长期,雌二醇组的表皮葡萄球菌菌株生长能力明显优于空白组。②表皮葡萄球菌初始粘附能力:ATCC35984和SE101在硅胶片上的初始黏附能力随雌二醇浓度的增加而得到加强,且在125pmol/L时黏附能力是最强的(P<0.05),之后随雌二醇浓度的增加其黏附能力无明显加强。而雌二醇对ATCC12228和SE40黏附在生物材料表面的能力无促进作用。③表皮葡萄球菌生物膜形成能力:在不同雌二醇浓度下,表皮葡萄球菌ATCC35984和SE101在硅胶材料表面形成的生物膜量随着培养时间逐渐上升。在培养4h时已初步形成生物膜,6h生物膜就达到一定的厚度,24h时生物膜达到最厚,48h和72h形成的生物膜较24h有所下降,差异有统计学意义(P<0.05)。ATCC35984在生物膜形成早期(4～6h)时,细菌生物膜的形成能力随雌二醇浓度增加出现抑制现象,其低雌二醇浓度组(≤50pmol/L)的生物膜较高雌二醇浓度组(≥125pmol/L)的厚,但从12h起形成的生物膜厚度就随雌二醇浓度增加而显著增加,并且在雌二醇浓度为125pmol/L作用下形成的生物膜最厚,差异有统计学意义(P<0.05);SE101同样在125pmol/L组中形成的生物膜最厚。当雌二醇浓度≥250pmol/L时,生物膜厚度反之有所下降,但仍明显大于低雌二醇浓度组(<50pmol/L)。表皮葡萄球菌ATCC12228和SE40在不同浓度的雌二醇中均无明显生物膜形成(OD<0.12)。④细菌生长动力:ATCC12228和ATCC35984的OD值都随培养时间的推移在不断增加;同一时间点比较,OD值也都随雌二醇浓度增加而增加(P<0.05)。4～6h时两株细菌的不同浓度雌二醇组生长都处于加速期,ATCC12228在12-48h时细菌生长速度较平缓,72h时又再次进入加速增长期;而ATCC35984在12-24时细菌生长速度较平缓,在48h时就进入加速增长期。当雌二醇浓度≥125pmol/L时,两株细菌在4h时的OD值明显较0和50pmol/L雌二醇组的高(P<0.05),随时间的推移,雌二醇≥125pmol/L组的OD值一直都较≤50pmol/L组的高(P<0.05)。⑤不同初始菌液浓度的ATCC35984细菌生长和生物膜形成:通过XTT法检测细菌生长动力发现随着培育时间的推移,1×l08CFU/mL菌液组的OD值始终高于l×l07CFU/mL菌液组。随雌二醇浓度的增加,l×l07CFU/mL和l×l08CFU/mL菌液组生长速度都随雌二醇浓度有增加;但不同于1×107CFU/mL菌液组的生长特征(④中已讨论过),1×108CFU/mL菌液在4～6h时各个雌二醇浓度组之间的OD值差异无意义(P>0.05),雌二醇≤50pmol/L组在12～24h时出现生长停滞情况,48h后又继续加速生长;而雌二醇≥125pmol/L组的细菌生长速度一直都在不断加速(P<0.05)结晶紫染色法检测到不同菌液浓度的表皮葡萄球菌ATCC35984形成生物膜的厚度随时间推移不断增加,4h和6h时,1×108CFU/mL菌液组的OD值明显高于 1×107CFU/mL 组(P<0.05);12h 时,1×108CFU/mL 菌液组的 OD 值与1×107CFU/mL组无明显差异(P>0.05);24～72h时,1×107CFU/mL菌液组的OD值明显较1×108CFU/mL组大(P<0.05)。1×107CFU/mL菌液组的OD值在24h是最大,而1×108CFU/mL菌液组的OD值在48h是最大,到72h时两组菌液的OD值均低于48h。在相同时间点,1 ×107CFU/mL和1×108CFU/mL菌液在125pmol/L雌二醇组的OD值均大于其它雌二醇浓度组(P<0.05)。⑥细菌生物膜厚度和代谢情况:CLSM测得6h时各雌二醇组生物膜厚度无明显差异(P>0.05);12～24h时雌二醇≥125pmol/L组的生物膜厚度均大于雌二醇≤50pmol/L组的,且雌二醇125pmol/L组的细菌生物膜厚度均明显大于其他雌二醇浓度的菌组(P<0.05);随时间推移,各组细菌生物膜厚度不断增加,24小时达到最大值(P<0.05)。通过死/活菌染色观察细菌生物膜的代谢情况,在细菌生物膜表层是以活菌为主,底层则以死菌为主。孵育12h时观察到形成的生物膜以活菌为主,到24h时就出现大量的死菌。⑦细菌生物膜的超微结构:ATCC12228和SE40未见生物膜结构。雌二醇浓度为125pmol/L时,ATCC35984和SE101在4h时可见初步形成的细菌团;6h时见大量细菌团覆盖在硅胶片表面;12h时即见将细菌团相互连接的纤维组织形成;24h时就见蜂窝式成熟的细菌生物膜结构;48h和72h时见生物膜结构出现分解。在雌二醇浓度为125pmol/L作用下形成的细菌生物膜范围最广、结构最致密、最丰富、层次最多。[结论]1.雌二醇能促进表皮葡萄球菌生长,且细菌生长动力有雌二醇浓度依赖性,提示雌二醇可能在维持细菌生存方面起一定作用。2.在表皮葡萄球菌生物膜形成过程中,高浓度雌二醇能显著增强细菌初始黏附能力,促进生物膜后期的大量形成,这可能是高雌二醇水平患者容易形成细菌生物膜的重要因素之一。3.生物膜形成阳性株在合适的高浓度雌二醇下,形成的生物膜更致密、多细胞群体组成的结构更加高度组织化,这可能是乳腺癌患者假体术后感染难治的原因之一。第二部分:雌二醇对表皮葡萄球菌生物膜相关基因的影响[目的]探讨雌二醇影响表皮葡萄球菌生物膜的可能分子机制。[方法]利用Real-time PCR法检测表皮葡萄球菌在雌二醇浓度分别为0、50、125、250、500pmol/L(模拟乳腺癌患者体内雌二醇水平)的条件下培养12h、24h、48h和72h后,正调控基因(aap、icaA、SarA)和负调控基因(Lux、RNAⅢ、icaR)mRNA表达的变化,了解相关基因在不同雌二醇浓度、不同时间下的表达情况。[结果]①aap基因在生物膜的形成期(12h)和成熟阶段(24h)时都出现表达增强,且在E2浓度为125pmol/L作用下表达最显著;②在生物膜形成的12h时,icaA的表达并未出现表达增强,但在24h时观察到在125pmol/L雌二醇作用下icaA基因mRNA开始出现轻度上调,到48h时250pmol/L雌二醇作用下icaA基因的mRNA出现显著上调;③在12h时,sarA的mRNA在所有雌二醇浓度中都是下调,但有随雌二醇浓度增加而上调的趋势,24h时在125pmol/L组出现明显上调,48h时在250pmol/L组出现显著上调。④在表皮葡萄球菌生物膜形成期(12h)和新生物膜建立期(72h),LuxS都是被抑制的,且随着雌二醇浓度的增加LuxS的抑制更显著;⑤RNAⅢ基因在生物膜形成的48h时,在125pmol/L组表达增强;在72h时,随雌二醇浓度增加RNAⅢ基因被抑制;⑥在生物膜形成的12h时,icaR基因mRNA随雌二醇浓度增加是下调的,24h和48h时出现表达增强,并且24h时在E2浓度为125pmol/L作用下表达增强最显著;[结论]1.在生物膜形成初期,正调控基因占主导地位;在生物膜成熟后期,正调控基因作用较前减弱,同时负调控基因开始发挥作用;在生物开始膜崩解时,负调控基因占主导地位。2.高浓度雌二醇作用下,正调控基因和负调控基因作用都得到加强,提示雌二醇可能通过同时影响正、负调控基因达到促进生物膜形成的作用。第三部分:雌二醇对卵巢去势大鼠体内假体细菌生物膜的影响以及与包膜挛缩的关系[目的]建立不同雌二醇血清水平的大鼠模型,探讨雌二醇对动物体内假体细菌生物膜形成和包膜挛缩的作用,评价雌二醇对动物清除感染能力的影响。[方法]利用双侧卵巢去势手术和雌二醇注射,模拟建立具有不同雌二醇血清水平的动物模型;植入硅胶片、注入表皮葡萄球菌(ATCC12228或ATCC35984)感染实验动物,感染60天后处死大鼠,计算主要脏器的感染率和感染细菌的菌落计数,同时利用显微镜观察感染脏器炎性细胞的浸润情况;扫描电镜观察硅胶片表面生物膜的形成情况;病理方法观察挛缩包膜的结构。[结果]①去势组大鼠雌二醇浓度为46.886(±3.965)pmoL/L,高E2组大鼠的雌二醇浓度为 152.381(±10.455)pmoL/L,低 E2 组大鼠的雌二醇浓度84.962(±24.735)pmoL/L(P<0.05);②在高E2组中,感染ATCC35984的实验老鼠脏器感染率增高,菌落数也显著高于正常组和低E2组(P<0.05);③高E2组中发生高达80%的包膜挛缩率(GradeⅢ/Ⅳ),显微镜下可见大量致密的纤维组织结构;扫描电镜下观察到ATCC35984感染下,高E2组中见明显成熟的细菌生物膜形成;④动物在感染ATCC35984的第1、3、7天时,低E2组的血清IFN-γ、TNF-α水平均显著高于高E2组,高E2组的IL-6、Ig-G显著高于低E2组(P<0.05);⑤ATCC35984感染后,高E2组中CD3、CD4、CD4/CD8水平均从感染第1天就出现下降,至感染第3天达到最低水平,随后逐渐上升;CD8水平从感染第1天开始出现上升,至感染第3天达到最高水平,随后逐渐下降(P<0.05)。[结论]1.利用去势手术可成功构建不同雌二醇血清水平的大鼠模型;2.高浓度的雌二醇能提高假体包膜挛缩发生率,促进胶原纤维的增生,形成厚而致密的包膜,这可能是诱发假体包膜挛缩的重要因素之一;3.高浓度的雌二醇能诱导大量炎性细胞的浸润,使周围组织发生严重的炎性反应;进一步加重感染宿主的免疫失衡状态,增加感染播散的风险,这可能是造成宿主免疫系统紊乱的原因之一。