结缕草属(Zoysia Willd.)植物是禾本科画眉草亚科的多年生草本植物,是世界公认的优良暖季型草坪草,由于结缕草属植物的研究工作起步较晚,目前结缕草品种的开发还远远不能满足市场的需求,还有许多问题有待于进一步研究和解决。本研究充分利用已拥有的结缕草属植物种质资源,在前期工作的基础上,首先通过分子标记的手段对涵盖了中国各个分布和应用区域的5种1变种共96份种源材料的遗传多样性进行了研究,为中国丰富的结缕草属植物种质资源的开发利用及遗传改良提供科学依据。在此基础上,针对目前关于结缕草属植物抗寒性、青绿期及外部性状遗传基础和遗传机制的研究缺乏这一现状,利用“主基因+多基因混合遗传模型”分析方法,对结缕草属植物重要的外部性状(包括营养性状、生殖性状、抗寒性、青绿期)进行遗传分析,并通过关联分析法对与结缕属植物抗寒性和青绿期相关联的分子标记进行了研究,有关研究结果如下：1结缕草属植物种质资源多样性研究1.1结缕草属植物SSR反应体系的优化及其应用以结缕草属植物DNA为模板,应用正交设计法对简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)反应体系中的各个主要影响因子进行了优化筛选,并通过比较不同浓度的模板DNA对聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)的影响,确立了适合结缕草属植物SSR-PCR反应的最佳体系。结果表明,10uL的SSR反应体系中各组分的最适浓度分别为：10×PCR缓冲液,Mg2+2.5mmol/L, dNTP200μmol/L,正反向引物分别为0.6μmol/L, Taq DNA聚合酶0.5U,模板DNA的用量在30-9Ong均可。并利用该优化体系,通过30对SSR引物对包含结缕草属植物4个种的10份材料进行了种质鉴定,结果发现Xgwm系列SSR引物,可以有效地用于结缕草属植物不同种源间的鉴定及遗传多样性研究。1.2结缕草属植物种质资源多样性的SSR标记分析通过SSR分子标记技术对结缕草属植物5种1变种共96份种源进行种质资源多样性分析,结果表明,①结缕草属种质间存在丰富的遗传多样性,29对SSR引物共扩增出282条清晰的用于多样性分析的谱带,其中多态性条带272条,多态性比率(PPB)为96.45%,Nei’S(1973)基因多样性指数(H)为0.2203,Shannon信息指数(Ⅰ)为0.3504。②应用Nei—Li相似系数法估算了96份材料间的遗传相似系数(GS),其GS在0.5922-0.9362,平均为0.7811。不同种之间,结缕草与中华结缕草、沟叶结缕草与细叶结缕草中的部分材料遗传相似系数较高,遗传距离较近。大穗结缕草Z010和长花结缕草Z122与其它结缕草的遗传相似系数都相对较低。同一个种内,结缕草、中华结缕草和沟叶结缕草种内遗传变异均较大,GS分别为0.5922-0.9362,0.6879-0.9078和0.6738-0.8582。③通过分子系统聚类法,将96份种源分为6个大的类群,其中第一大类为包含结缕草、中华结缕草和少量沟叶结缕草三个种的87份种质材料,占所有材料的90.6%。沟叶结缕草和细叶结缕草聚为一小类。大穗结缕草Z010、长花结缕草Z122、沟叶结缕草Z095以及结缕草Z115分别单独聚为一类。从亚群来看,除个别材料自行一类,遗传基础与其它材料差异较大外,其余材料也并不是同一个种的材料完全相聚,基本上是结缕草与中华结缕草交叉相聚,沟叶结缕草与细叶结缕草交叉相聚,沟叶结缕草与结缕草、中华结缕草也有交叉聚类现象。1.3结缕草属植物种质资源多样性的SRAP标记分析通过相关序列扩增多态性(Sequence-related Amplified Polymorphism, SRAP)分子标记技术对结缕草属植物5种1变种共96份种源进行多样性分析,结果表明,①结缕草属种质间存在丰富的遗传多样性,54对SRAP引物共扩增出362条清晰的用于多样性分析的谱带,其中多态性条带337条,多态性比率(PPB)为93.09%,Nei′S(1973)基因多样性指数(H)为0.2409,Shannon信息指数(Ⅰ)为0.3746。②应用Nei-Li相似系数法估算了96份材料间的遗传相似系数(GS),其GS在0.5939-0.9834之间,平均为0.7588。不同种之间,结缕草与中华结缕草、沟叶结缕草与细叶结缕草中的部分材料遗传相似系数较高,遗传距离较近。大穗结缕草Z010和长花结缕草Z122与其它结缕草的遗传相似系数都相对较低。同一个种内,结缕草、中华结缕草和沟叶结缕草种内遗传变异均较大,GS分别为0.5994-0.9834,0.6243-0.9807和0.6630-0.9475。③通过分子系统聚类法,将96份种源分为七个大的类群,其中第一大类和第二大类均包含结缕草、中华结缕草和少量的沟叶结缕草种源；第三大类群主要包括4份美国引进的材料；第四大类主要包括沟叶结缕草和细叶结缕草；大穗结缕草Z010、长花结缕草Z122和结缕草Z115都单独聚为一类。从聚类结果可以看出,结缕草、中华结缕草和沟叶结缕草均有交叉聚类现象,并不是同一个种的材料完全相聚,个别种源自行一类,遗传基础与其它材料差异较大,从遗传聚类图可以很明确地看出96份种源间的遗传距离及亲缘关系。1.4SSR标记与SRAP标记对结缕草属植物种质资源多样性研究结果的比较比较两种标记的多样性分析结果,发现两种标记的研究结果非常一致,从聚类结果来看,两种标记均表现为同一个种的材料基本上聚在一起,其中结缕草与中华结缕草交叉聚类,沟叶结缕草与细叶结缕草交叉聚类,而大穗结缕草和长花结缕草单独相聚,个别材料如结缕草Z115,因具有遗传特异性而单独聚为一类。对基于这两种标记的样品遗传相似系数矩阵进行相关性分析,结果表明,两种标记检测的遗传相似性呈极显著的正相关(r=0.699>r0.01,n=4560),进一步验证了两种标记聚类结果的相似性。两种标记都可以有效地用于结缕草属植物种质资源多样性的研究中。2结缕草属植物重要性状的遗传分析2.1结缕草属植物杂交后代杂种真实性鉴定通过在抗寒性、青绿期、营养性状和生殖性状各个方面均存在差异的两份结缕草属种源材料,即结缕草Z136和中华结缕草Z039相互杂交,获得正反交F,群体,拟通过所得F,群体对结缕草属植物营养性状、生殖性状、抗寒性和青绿期的遗传特性作进一步的研究。本文首先通过SRAP分子标记技术对结缕草属植物Z136×Z039的184个正交后代和103个反交后代的杂种真实性进行了鉴定,在200对SRAP引物组合中筛选出26对父本(Z039)有特异带的引物组合,35对母本(Z136)有特异带的引物组合,从正反交父本有特异带的引物组合中,分别选取了11对引物组合对后代真实性进行鉴定,结果有168个正交后代和99个反交后代因具有父本的特异带被鉴定为真杂种,其余的16个正交后代和4个反交后代因不具有父本的特异带被认为是自交种。杂种真实性的鉴定结果为杂交后代的进一步研究及应用奠定了良好的基础。2.2结缕草属植物营养性状的遗传分析应用植物数量性状主基因+多基因混合遗传模型分析方法对F,群体的密度、草层高度、叶长、叶宽、叶长／叶宽、节间长度、节间直径和节间长度／节间直径进行遗传分析,以初步明确这些性状的遗传特性。结果表明：①在调查的8个性状中,正反交杂交后代中每一个性状的变异范围均超出了双亲的变异范围,变异系数不同性状差异较大,密度的变异系数最大,其次为节间长度／直径和节间长度,叶宽的变异系数最小,其它性状的变异系数居中。②草层高度、叶长、叶宽、叶长／叶宽、节间直径和节间长度／直径的正反交后代的表型值存在显著差异,可能有母体遗传效应,密度和节间长度正反交后代间无显著差异。③密度的最佳遗传模型正反交均为B-1模型,即两对主基因的加性-显性-上位性遗传模型,正交的主基因遗传率为93.67%,反交的主基因遗传率为63.22%。草层高度、叶长、叶宽、叶长／叶宽和节间长度正反交后代群体的最佳遗传模型均为A-0模型,即无主基因模型。节间直径的正交为一对主基因的遗传模型,反交为无主基因模型,节间长度的正交为无主基因模型,反交为一对主基因模型。2.3结缕草属植物生殖性状的遗传分析应用植物数量性状主基因+多基因混合遗传模型分析方法对F1群体的花序密度、生殖枝高度、花序长度、每穗小穗数、小穗长度、小穗宽度、小穗长度／宽度进行遗传分析,以初步明确这些性状的遗传特性。结果表明：①在调查的7个性状中,正反交杂交后代中每一个性状的变异范围均超出了双亲的变异范围,变异系数不同性状差异较大,花序密度的变异系数最大,其次为生殖枝高度和每穗粒数,小穗长度和宽度的变异最小,花序长度的变异居中。②花序密度、生殖枝高度、小穗长度和小穗长／宽正反交后代的观测值存在显著差异,可能有母体遗传效应,花序长度、每穗粒数和小穗宽度正反交后代间的观测值无显著差异。③花序密度正反交后代群体的最佳遗传模型为存在两对主基因控制的遗传模型,生殖枝高度、花序长度和小穗宽度正反交后代群体的最佳遗传模型均为A-0模型,即无主基因模型。每穗粒数正交为一对主基因的遗传模型,反交为无主基因模型,小穗长度的正交为无主基因模型,反交为一对主基因模型。小穗长／宽正交的最适遗传模型为B-1模型,即两对主基因的加性-显性-上位性遗传模型,主基因遗传率为42.72%,反交群体的最适遗传模型为B-2模型,即两对主基因的加性-显性遗传模型,主基因遗传率为98.81%。2.4结缕草属植物抗寒性的遗传分析通过改良电导率外渗法对F,群体的抗寒性进行鉴定,并应用植物数量性状主基因+多基因混合遗传模型分析方法对F,群体进行遗传分析。结果表明：①正反交后代的抗寒性变异范围均较大,正交的变异范围为-0.3～-11.6℃,反交的变异范围为-1.7～-10.9℃,均远远超出了双亲的抗寒性(-9.1℃和-3.3℃),正反交后代的平均值相差不大,正交后代LT50的平均值为-6.0℃,反交后代LT50的平均值为-6.3℃,均间于双亲之间,没有发现明显的母性遗传现象。②次数分布分析结果表明,正反交F,群体的抗寒性均呈混合正态分布,表现出明显的主基因+多基因的遗传特征。③遗传分析结果表明,结缕草属植物的最适遗传模型为B-4,即结缕草属植物的抗寒性受两对等加性的主效基因控制,正反交主基因遗传率分别为77.27%和79.60%。2.5结缕草属植物青绿期的遗传分析应用植物数量性状主基因+多基因混合遗传模型分析方法对F1群体青绿期进行遗传分析,以初步明确结缕草属植物青绿期的遗传特性。结果表明：①正反交后代的青绿期变异范围均较大,正交的变异范围为178-261天,反交的变异范围为188-253天,均远远超出了双亲的青绿期(248天和231天),正反交后代的平均值分别为223.6天和216.8天,两者存在显著差异,结缕草属植物的青绿期有母体遗传效应。②正反交的遗传模型差异较大,母体遗传效应和环境效应对青绿期的影响明显,正交F,群体青绿期的最适遗传模型为A-0模型,即无主基因模型,而反交F,群体青绿期的最适遗传模型为B-4模型,即两对主基因的等加性遗传模型,且反交的主基因遗传率较高,为94.35%。3与结缕草属植物抗寒性和青绿期相关联的分子标记的研究利用29对SSR引物和54对SRAP引物对96份结缕草属植物种质资源的基因组变异进行扩增扫描,共检测到254个SSR多态性标记位点和338个SRAP多态性标记位点,对这些多态性位点按原始数据、种分类、采集地分类、NTSYS软件分类(分别分为2、3、4、5、6类),共8种情况下与抗寒性和青绿期作多标记联合分析,结果检测到与抗寒性相关联SSR标记位点3个、SRAP标记位点1个,分别为：Xgwm131-3B-187、Xgwm469-6D-194、Xgwm234-5B-244和Mell+Em7-406,其中前两个标记在8种分类情况下均与抗寒性存在关联性,后两个标记除了按采集地分类外,在其余7种分类情况下均与抗寒性相关联；检测到与青绿期相关联的SSR标记位点3个、SRAP标记位点2个,分别为：Xgwmlll-7D-34、Xgwm102-2D-97、Xgwm132-6B-225和Mel9+Em5-359,Mel6+Em8-483.其中标记位点Xgwm132-6B-225在8种分类情况下均与青绿期有关联性,标记位点Xgwm111-7D-34和Me19+Em5-359,除了按分子聚类图分为6类的情况下外,在其余7种情况下都检测到了与青绿期的相关性,标记位点Xgwm102-2D-97和Me16+Em8-483分别在6种和5种分类情况下检测到与青绿期的关联性。