草鱼是我国乃至世界养殖产量最高的鱼类，具有悠久的养殖历史。目前，草鱼养殖病害严重，带来了很大的经济损失，开展草鱼免疫因子研究，开发防病产品、培育抗病力强的草鱼新品种是一条重要研究途径。明胶酶基因是一类重要的免疫因子，它包括基质金属蛋白酶-2（MMP-2）基因和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）基因。本文克隆了草鱼这2种明胶酶基因及其抑制剂——基质金属蛋白酶抑制剂-2b基因和热休克蛋白60基因，分析了它们的理化性质、氨基酸结构，比较了它们的同源性，采用福尔马林灭活嗜水气单胞菌液对这些基因进行了诱导，研究它们在草鱼不同发育过程、不同组织及其受嗜水气单胞菌感染后的表达情况，取得了如下结果。1．通过同源克隆策略获得了草鱼MMP-2、MMP-9和HSP60基因部分cDNA片段，从本实验室已构建的草鱼头肾均一化文库中获得TIMP-2b基因部分cDNA片段；由RACE技术发现这4个基因的全长序列分别为3102bp，2880bp，2434bp，1224bp；分别含有编码658（1974bp），675（2025bp），575（1728bp），218（657bp）个氨基酸的开放阅读框，MMP-2，MMP-9，TIMP-2b分别含有29，20，24个氨基酸的信号肽序列。2．BLAST分析发现，草鱼MMP-2，MMP-2，TIMP-2b和HSP60都是高度保守的蛋白家族成员，草鱼与鲤鱼的MMP-2、MMP-9氨基酸序列相似度最高，分别达到94%、89%；草鱼与斑马鱼TIMP-2b氨基酸序列相似度最高，为83.9%；草鱼与金丝鱼HSP60氨基酸序列相似度最高，达96.9%；选取各自蛋白家族不同物种氨基酸序列，通过MEGA5.0软件，使用NJ和ML两种方法构建系统进化树，均发现草鱼与其它硬骨鱼类的的亲缘关系最近，这些结果都支持了传统的进化理论，反应了其实际的亲缘关系。3．多序列比对和蛋白功能结构域分析发现，MMP-2、MMP-9氨基酸序列均含有N端信号肽、前肽，插入催化结构域的3个重复的类纤维连接Ⅱ型蛋白结合区和C端的类血红素结构域，但他们的氨基酸序列一致度只有47.2%，表明他们的功能具有一定差异性。草鱼TIMP-2b氨基酸序列包含一个信号肽，N-端和C-端结构域。草鱼HSP60氨基酸序列包含ATP/Mg²⁺结合位点、一个铰链结构域和一个环状寡聚结构。4．利用实时荧光定量PCR技术对健康草鱼各组织及使用灭活嗜水气单胞菌诱导后4个基因的表达谱进行检测，结果显示：4个基因在所有被检测组织中均有表达，表明他们可能在草鱼体内发挥广泛的作用；MMP-2基因在血液、头肾和鳍条发现较低的表达水平，MMP-2基因经灭活的嗜水气单胞菌诱导，在脾脏和头肾组织表达量，4小时显著性上调，24小时显著下调；MMP-9基因和TIMP-2b基因均在血液、头肾、体肾和脾脏中显著高表达，草鱼MMP-9基因和TIMP-2b基因诱导后，所有组织的表达量均显著提高，MMP-2在肠组织的表达量变化不显著，MMP-9基因在头肾和心脏的的上调最具显著性；HSP60基因在血液和肝脏组织中具有显著高表达，HSP60基因表达情况有明显时间节点，表达量在第三天达到峰值，第七天表达水平与对照组相似。分析健康草鱼和细菌注射后草鱼体内4个基因的表达情况，表明嗜水气单胞菌可以影响草鱼体内的明胶酶基因及其抑制剂基因的表达情况，从而对机体产生一定的影响。5．利用实时荧光定量PCR技术对4个基因在草鱼胚胎发育过程中的表达情况进行检测：在卵子中均检测到4个基因的表达，这表明他们可能遗传于母本；其中草鱼MMP-9与TIMP-2b基因的表达谱及其相似，表达量在后期有所升高；草鱼MMP-2与HSP60基因的表达谱比较相似，都在胚胎发育的早期具有较高的表达情况。4个基因均在胚胎发育早期及检测到表达，表明他们在胚胎发育过程中具有重要的作用。尤其是MMP-2和HSP60基因在早期的高表达，表明他们可能参与到胚胎早期的细胞分裂和组织分化的过程中。通过以上研究结果可见，草鱼在受到嗜水气单胞菌侵袭后，体内基因表达已发生混乱，这可能导致疾病发生并不断恶化的原因之一。4种基因在免疫器官中的表达量均较高，且受到嗜水气单胞菌感染后表达量都出现显著变化，证明其参与到草鱼免疫反应当中。4个基因在胚胎发育的早期就已存在，表明其在胚胎发育过程中具有重要的功能。