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目的:利用DEN(二乙基亚硝胺)诱导大鼠肝癌模型,并从肝功能、炎性因子及细胞坏死性凋亡途径等方面探讨健脾益气方下调NLRP3对肝癌组织细胞坏死性凋亡的影响。方法:制备DEN诱导的大鼠肝癌模型,健康雄性SD大鼠100只,随机分为空白对照组(10只)和模型组(90只),其中模型组按照70 mg/kg体重给予腹腔注射DEN,空白对照组给予腹腔注射同比例生理盐水,每周一次连续注射10周。自造模开始后分别在第0、6、13周末随机从模型组中选取10只大鼠进行动态观察:取血分离血清并取完整肝脏组织保存。将剩余的模型大鼠随机分为六组:模型组、健脾益气方低、中、高剂量组(即JP-L、JP-M、JP-H)、NLRP3抑制组和Caspase-1抑制组。在第16周末进行药物干预,每日1次、连续4周。其中模型组大鼠以10.5g/kg的生理盐水灌胃,JP-L、JP-M、JP-H三个剂量组分别以5.25g/kg、10.5g/kg、21g/kg剂量给予健脾益气方药,NLRP3抑制组以4.5 mg/kg/d剂量腹腔注射MCC950,Caspase-1抑制组以4.5 mg/kg/d剂量腹腔注射VX-765,在第20周末取血分离血清并取完整肝脏组织保存,光镜下观察各组大鼠肝脏病理变化,采用生物化学法检测造模过程及药物干预后各组大鼠血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、免疫球蛋白(GLO)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、碱性磷酸酶(ALP)的含量,用ELISA法检测造模过程及药物干预后各组血清炎症因子HMGB-1、TNF-α、CTSB、IL-1β和NF-κB含量的变化,用Western blot法检测药物干预后各组大鼠肝脏组织procaspase-1、ASC、NLRP3、RIP1、RIP3、MLKL、RAGE和TLR4的表达水平。结果:1.在DEN诱导肝癌形成过程中,造模大鼠在造模后第20周均形成肝癌,大鼠肝脏指数明显升高(与第0周比较,P<0.05),且大鼠肝脏形态及病理切片均发生相应的改变;血清中TNF-α、CTSB和NF-κB的含量随着造模进程逐渐升高;在造模第20周(肝癌期)达到最高(与第0周比较,P<0.01),大鼠在造模后第20周均形成肝癌。通过免疫组化检测到肝组织中TNFRI、TNFRⅡ、RIP1、RIP3和MLKL蛋白表达上调(与第0周比较,P<0.01)。2.(1)肝癌模型大鼠经健脾益气方与抑制剂药物干预之后,健脾益气方药的各个剂量组均可减弱肝功能的恶化并降低炎症因子的表达(与模型组比较,P<0.01),且JP-M组效果要优于JP-L、JP-H剂量组。JP-M剂量组与Caspase-1抑制组的TNF-α含量显著降低(与模型组相比,P<0.01),NLRP3抑制组的TNF-α含量明显降低(与模型组相比,P<0.05);大鼠血清IL-1β的含量测定中,NLRP3抑制组含量显著降低(P<0.01),JP-L、JP-H剂量组的含量明显降低(与模型组比较,P<0.05)。药物治疗组别的大鼠血清中HMGB-1的含量在显著性降低(与模型组比较,P<0.01)。(2)Western blot结果显示,健脾益气方药的不同剂量组均可抑制大鼠肝脏组织的procaspase-1、NLRP3、ASC蛋白的表达,JP-M剂量组下调效果更佳(与模型组比较,P<0.01),除JP-H剂量组外的其余各治疗组对ASC和Procaspase-1的抑制效果显著(与模型组比较,P<0.01)。尤其时NLRP3抑制组大鼠肝脏组织中相关因子的蛋白表达水平受到抑制,且效果最佳(与模型组比较,P<0.01)。3.药物各剂量治疗组CTSB含量显著降低(与模型组相比,P<0.01);药物治疗组别的大鼠肝脏组织中RAGE蛋白表达含量均显著性降低(与模型组比较,P<0.01);同时,NLRP3抑制组的大鼠肝脏组织中TLR4蛋白表达含量在显著性降低(P<0.01);RIP1、RIP3、MLKL蛋白的表达,JP-M剂量组下调效果更佳(与模型组比较,P<0.01)。结论:1.利用DEN成功制备大鼠肝癌模型。其中大鼠血清中相关炎症因子TNF-α、HMGB-1、CTSB、NF-κB可作为DEN诱癌过程中肝细胞损伤的标志因子,且通过免疫组化检测到肝组织中TNFR1、TNFRⅡ、RIP1、RIP3和MLKL蛋白表达上调,表明DEN诱导大鼠肝癌中可能出现细胞坏死性凋亡,对肝癌发生发展过程发挥重要作用。2.通过实验验证健脾益气方能够下调炎症因子HMGB-1和TNF-α,以及肝脏组织细胞中Procaspase-1、ASC和NLRP3的蛋白表达水平。来抑制细胞炎性坏死过程中的炎性状态,从而起到抑制肝癌发生发展的作用,为健脾类方药进一步的开发应用提供了基础研究支持。3.通过实验得出健脾益气方下调了大鼠血清中CTSB的含量,以及两个关键受体RAGE和TLR4蛋白的表达水平。此外,健脾益气方也可下调肝脏组织细胞中RIP1、RIP3和MLKL的蛋白表达水平,表明健脾益气方可通过下调TNF-α介导的RIP3-MLKL信号通路及HMGB-1介导的RAGE(或TLR4)/Cathespin B信号通路,抑制细胞坏死性凋亡,从而干预肝癌炎症微环境,抑制肝癌的发生发展。