背景与目的：20世纪70年代,纳米材料和纳米技术随着现代科学仪器的广泛应用引起了人们的注意和重视,并逐步应用于药学领域,产生了纳米给药系统。20世纪90年代开始逐渐成为药剂学领域的研究热点之一。所谓的纳米给药系统指的是药物与药用材料一起形成的粒径为1-1000m的纳米级药物输送系统,为近年来药剂学领域颇为活跃的一系列新型超微小给药系统的统称。纳米粒(nanopartilcles, NP)是由天然或合成高分子材料制成的粒径介于1～1000nm固态胶体粒子,包括纳米球(Nanospheres)和纳米囊(Nanocapsules)。活性组分(药物、生物活性材料等)能溶解、包裹于粒子内部,或者吸附、附着于粒子表面。NP具有众多优点：为非生物材料,无免疫原性、细胞毒性；有较高的基因转染效率,可获得靶基因的长期稳定表达；可保护药物或靶基因不受机体血浆或组织细胞中多种酶类和补体的破坏。NP通过表面或通过特殊材料的使用达到靶向目的,促进药物的吸收和提高药物的生物利用度,稳定性好,尤其是可实现细胞内靶向的特点,使其在肿瘤治疗领域有着广阔的应用前景,也是目前国内外实现肿瘤靶向治疗的研究热点。白血病是一大类严重威胁人类健康的造血系统恶性肿瘤,目前的治疗方法主要有化疗、造血干细胞移植和分子靶向治疗。化疗只能取得短暂缓解,且化疗药毒副作用明显、选择性差。异基因干细胞移植因供者有限、移植物抗宿主病和移植相关死亡率高以及经济情况等原因使其使用受到很大限制,临床只有不到半数的患者可能接受这种治疗。分子靶向治疗的应用也受到一定的局限性。这就为我们提出了寻找新的靶向治疗药物的课题。近年来开发天然产物成为发展新的抗白血病药物的思路。青蒿素是我国从菊科植物青蒿中的提取物,含内过氧化基团(-C-O-O-C-)的具有倍半萜结构的抗疟特效药。为提高水溶性,人工半合成的蒿甲醚(artemether)、蒿乙醚(srteether)、双氢青蒿素(dihydroartemisinin)和青蒿琥酯等衍生物相继问世。近年研究发现青蒿素及其衍生物对多种肿瘤细胞等都具有较强的抑制作用。青蒿琥酯(Artesunate,以下简称Art)更是对55种人体肿瘤细胞系有抑制作用,其中最敏感的为白血病及结肠癌细胞,中度敏感的有黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、中枢神经系统肿瘤及肾癌细胞等,非小细胞肺癌敏感性最差,基于此美国国家癌症研究所已把其纳入抗癌药物筛选与抗癌活性研究计划中。本课题组前期研究工作证实Art的抗肿瘤效应主要表现在肿瘤细胞内的富含的铁催化Art的内过氧化基团断裂,产生的以碳为中心的自由基诱发细胞凋亡。我们的研究证实：由于恶性肿瘤细胞膜表面过度表达转铁蛋白受体1 (transferrin receptor 1, TfR 1)即CD71,而运载Fe2+的转铁蛋白(transferrin, Tf)正是TfR1的天然配体,二者通过受体-配体途径结合后运载Fe2+进入细胞内,Art可能通过减低TfR1的表达使白血病K562细胞经TfR1-Tf途径摄取铁减少,通过降低二价金属离子转运蛋白(divalent metal transporter 1,DMT1)的表达,使细胞从内吞体转运到细胞浆的Fe2+减少,线粒体可利用铁也减少,通过减少膜铁转运蛋白1(ferroportin 1,FPN1) mRNA的表达,使细胞铁外流减少,进而抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。国内外研究表明,将Art与铁负荷转铁蛋白(hollo-Tf)共价结合后较单用Art对肿瘤细胞的生长抑制大大增强,说明Art与Tf在抗肿瘤作用上具有协同效应,这也为进一步研发新的Art抗肿瘤剂型提供了科研思路。本研究着眼于减低药物的毒性、延长药物的半衰期,提高生物利用度、增强抗肿瘤疗效、减低肿瘤耐药等出发点,将Art制成适用于人体可生物降解的纳米粒。普通NP进入循环系统后,易被单核吞噬细胞系统(mononuclear phagocyte system, MPS)的巨噬细胞以及多型核白细胞吞噬,而被迅速清除,难以到达靶组织,靶细胞亲和力弱,靶组织中沉积量少,为了避免NP被巨噬细胞迅速清除和提高靶组织中药物沉积量,延长其在体内的循环时间,增加药物对血脑屏障的渗透,在制备过程中,用具有一定亲水性和柔韧性的聚合物聚乙二醇(PEG)和表面活性剂泊洛沙姆(Poloxamer)对纳米载体进行表面修饰,从而提高普通NP的稳定性、靶向性。聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)是经美国FDA批准用于人体使用的可生物降解的高分子聚合物,经甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰后成为聚乙二醇单甲醚-聚乳酸-乙醇酸亲性嵌段共聚物(mPEG-PLGA)。以mPEG-PLGA为高分子材料载体,同时以Poloxamer为表面活性剂,制成表面极具亲水性,静脉注射后不易被MPS的巨噬细胞识别吞噬的新型长循环纳米粒,又称隐形纳米粒或“空间稳定”纳米粒,但此时的纳米粒仅具有被动靶向性。为了使制备的NP具有主动靶向性,将肿瘤细胞膜表面特异性的可识别配体即Tf结合在载药纳米粒载体上,Tf通过与肿瘤细胞表面的受体(TfRl)进行特异性结合,使药物能够准确送到靶区,实现对肿瘤组织(细胞)的靶向治疗,从而提高疗效,减少给药剂量和毒性反应,这也是制备该新型抗肿瘤纳米粒的初衷。transferrin是一种参与机体铁离子运输的糖蛋白,Tf-TfRl介导的内吞作用是生物细胞最具特点的转运过程之一,Tf也因此作为天然的靶向配体备受青睐。本研究第一部分首先在白乳化作用下形成mPEG-PLGA-Art-NPs,再将Tf以静电吸附作用偶联在纳米粒上,形成Tf-mPEG-PLGA-Art-NPs(以下简称Art-NPs),这种纳米粒具有主动靶向和聚乙二醇被动靶向的双重功能,能够特异性地识别肿瘤细胞表面的TfR1并通过Tf-TfR1途径,将所载抗肿瘤药物送入到肿瘤组织(细胞),然后对制备的纳米粒进行粒径及分布、zata电位、载药量、包封率、体外释放等理化性质进行考察,第二部分研究白血病K562细胞对纳米粒的吞噬及其抑制K562细胞生长的作用,第三部分小鼠体内试验进行纳米粒药代动力学及药物组织分布情况的研究,整个实验初步实现对此纳米粒体内外性质的评估。研究方法：1.应用改良的自乳化法／溶剂扩散法(modified-spontaneous emulsion solvent diffusion method, modified-SESD method)简称modified-SESD法制备Art-mPEG-PLGA-NPs,采用Marsshall氏法制成异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记的Tf即FITC-Tf溶液,二者按体积比为1：1,避光、4°下反应得到Tf-mPEG-PLGA-Art-NPs(简称Art-NPs)。2.应用扫描电镜表征纳米粒的形态；激光散射粒度测定仪测其粒径分布及Zeta电位；高效液相色谱法(HPLC)测定Art-NPs的载药量、包封率。3.流式细胞仪检测多种血液系统恶性肿瘤细胞株(K562、Rajj、Molt-4、HL-60、Jurkat)中各自膜表达CD71阳性细胞百分数,选取K562细胞为实验对象,Art-NPs分别以12.5μg/mL、25μg/ml、50μg/mL、100μg/mL体外分别处理细胞24h、48h、72h,通过MTT法检测各组的OD值,计算、比较各组细胞的相对抑制率。选取最大细胞抑制浓度,比较Art-NPs组与Art组、空载体纳米粒组分别处理细胞24h、48h、72h后的抑制率大小。Hoechst33342染色观察K562细胞凋亡改变。瑞氏吉姆萨染色观察Art-NPs分别处理K562细胞和小鼠腹腔巨噬细胞24h和48h后吞噬Art-NPs现象。HPLC测定纳米粒5天体外释药情况。4.以正常小白鼠为研究对象,在小鼠尾静脉分别注射Art生理盐水(Art组即对照组)、mPEG-PLGA-Art-NPs生理盐水溶液(PEG组)Tf-mPEG-PLGA-Art-NPs(Tf组)生理盐水溶液,在给药5min、15 min、25 min、30min、40min、60min、120min、180min、240 min后采血,HPLC测定不同时间点的血药浓度,绘制药时曲线,同时分别在15 min、40min、60min提取小鼠肝脏、脾脏、骨髓中药物浓度,初步考察各组中Art在体内组织器官分布情况。5.实验所得数据以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS 13.0软件进行统计学分析分析、处理数据。各实验组细胞增殖抑制率之间,进行重复测量因素的方差分析及单向方差分析。药动学参数采用Winonlin软件进行处理,三组动物实验中各时间点、血液及各组织器官药物浓度-时间变化进行析因分析及单向方差分析。以P<0.05为有统计学差异。结果：1. Art-NPs的形态、分布及理化性质的表征mPEG-PLGA-Art-NPs胶体液外观呈特有的淡蓝色乳光,吸附Tf后溶液透明呈淡黄色乳光,二者均无可见沉淀存在,放置3个月未观察到有相分离或絮凝发生。将少量该纳米悬液滴加到干净载玻片上,光镜下物镜放大100倍观察,镜下可见大片散在的点状超细小颗粒,呈球形或类球形,分布均匀,无粘连现象。透射电镜下观察为类球形实体粒子,表面光滑,分布均匀,平均粒径为(156.7±1.01) nm, zeta电位为-(26.23±1.86)mV,平均载药量为(14.5±0.2)%,平均包封率为(86.5±0.5)%。F／P=1.8。Tf与Art-NPs的平均结合率为23.5%。2.Art-NPs对肿瘤细胞增殖的抑制及促凋亡作用5种血液系统肿瘤细胞株HL-60、Molt-4、K562、Jurkat、Rajj细胞膜表达CD71的平均阳性率高低依次为98.85%、95.76%,90.84%,84.16%,72.69%。以K562细胞为研究对象,结果经重复测量的方差分析及单向方差分析提示：不同剂量(F=407.469,P=0.000)、不同药物作用时间(F=1301.003,P=0.000)对K562细胞的生长抑制均有显著差异,并且两者有显著的交互效应(F=6.932,P=0.002),提示Art-NPs对K562细胞的生长抑制作用呈时间—剂量依赖。进一步LSD多重比较分析显示,在所有观察时间内,各Art-NPs浓度处理组(除50μg／ml与100μg／ml比较),k562细胞抑制率均有显著差异(P均小于0.01)提示Art-NPs剂量越大、作用时间越长,Art-NPs对k562细胞增殖抑制越明显。在所有观察时间内,50μg／ml与100μg／ml(P=0.102)比较无显著性差异。100μg／ml的Art-NPs与空白、青蒿琥酯在24h,48h,72h的吸光度相比,其中作用24h,48h后Art-NPs抑制率小于对照组,而在72h抑制率明显高于对照组(70.4%>67.1%),有缓释作用。经瑞氏吉姆萨染色后可见K562细胞和小鼠腹腔巨噬细胞经处理48h较24h吞噬较多嗜酸性颗粒,为Art-NPs。实验组细胞(经12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml浓度Art-NPs处理)培养48h后均可见细胞数量明显减少,细胞大小不一,形态不规则,高倍镜可见细胞核固缩、凝集,并有凋亡小体,表现为明亮的颗粒状蓝染,随着浓度增加凋亡小体逐渐增多。3. Art-NPs体外释药情况Art-NPs模拟体内环境开始阶段有突释现象,5d后释放度达70%。以累积释放率和时间进行拟合,纳米的体外释放规律符合Higuchi方程：Q=4.11t1／2+27.05,R2=0.983。4. Art-NPs药代动力学特点Tf-mPEG-PLGA-Art-NPs及mPEG-PLGA-Art-NPs的血药浓度-时间曲线出现双峰现象。两种纳米剂型与对照组(Art组)相比结果存在显著差异,PEG组和Tf组的AUC(药时曲线下面积)和AUMC(一阶矩药时曲线下面积)显著大于Art组,分别是3.0倍、9.04倍和2.03倍、8.43倍。而Cl(清除率)明显小于对照组(P<0.01)。两实验组的T1／2(清除半衰期)分别为126.63min和172.76min,显著高于对照组(P<0.01),两实验组在体内的MRT(平均保留时间)也明显高于对照组,PEG组的Vss(稳态表观分布容积)较对照组无明显差异,而Tf组的Vss明显大于Art组。5. Art-NPs体内分布情况小鼠静脉(1)给药15min后,与对照组即Art组相比,PEG组血液(28.40±0.10vs.58.40±0.44,P=0.000)、肝脏(11.54±0.07 vs.4.56±0.06,P=0.001),脾脏(48.56±0.85 vs.9.97±0.02,P=0.000)Art浓度百分数显著升高,骨髓(11.52±0.10vs.27.07±0.29,P=0.000)Art浓度百分数显著降低；与Art组相比,Tf组血液(79.95±6.65 vs.58.40±0.44,P=0.000)、肝脏(5.13±0.07 vs.4.56±0.06,P=0.001)、脾脏(12.66±0.36 vs.9.97±0.02,P=0.001)Art浓度百分数显著升高,骨髓(2.27±0.07 vs.27.07±0.29,P=0.000)Art浓度百分数显著降低。(2)给药40min后：与Art组相比,PEG组的肝脏(50.60±0.53 vs.0.90±0.10,P=0.000)、脾脏中的Art分布的百分数(36.70±0.27 vs.11.80±0.27,P=0.000)明显升高,而Tf组在血液(71.70±0.80 vs.45.70±0.61,P=0.000)、肝脏中Art分布的百分数(6.30±0.26 Vs.0.90±0.10,P=0.000)明显升高,在脾脏(4.33±0.61 vs 11.80±0.27,P=0.000)、骨髓中的Art分布的百分数(17.60±.15 vs 41.6±1.41,P=0.000)明显降低。(3)给药60min后：与Art组相比,PEG组血液(19.00±0.12 vs.19.00±0.12,P=0.000)、骨髓(15.30±0.03 vs.29.59±0.65,P=0.000)Art浓度显著降低,而PEG组肝脏(7.18±0.05 vs.4.94±0.03,P=0.000)、脾脏(58.52±0.12 vs.14.46±0.66,P=0.000)Art浓度百分数显著升高；与Art组相比,Tf组血液(52.08±0.55 vs.49.97±0.66,P=0.002)、肝脏(7.34±0.0.03 vs.4.94±0.03,P=0.000)、脾脏(18.09±0.25 vs.14.46±0.66,P=0.000)Art浓度百分数显著升高,而Tf组骨髓(22.48±0.55 vs.29.59±0.65,P=0.000)Art浓度百分数显著降低。各组织器官Art分布情况：(1)血液：三组在不同时间点存在交互效应(F=72.622,P=0.000),组与组之间存在显著差异(F=935.619,P=0.000),时间点之间存在显著差异(F=557.151,P=0.000)。(2)肝脏：三组之间存在交互效应(F=3410139,P=0.000),组与组之间存在显著差异(F=3362905,P=0.000),时间点之间存在显著差异(F=4382466,P=0.000)。(3)脾脏：三组之间存在交互效应(F=8617.393,P=0.000),组与组之间存在显著差异(F=63409.888,P=0.000),时间点之间存在显著差异(F=63409.888,P=0.000)。(4)骨髓：三组之间存在交互效应(F=7768.881,P=0.000),组与组之间存在显著差异(F=27298.373,P=0.000),时间点之间存在显著差异(F=60274.729,P=0.000)。结论：1.本实验Art-NPs通过改良的自发乳化／溶剂扩散法经过多次工艺化改进乳化剂及其比例、调整搅拌速度、挑选有机相等诸多条件,摸索出最佳制备条件,最终制备出具有粒径小(156nm左右)、高载药量(>80%)及包封率(15%左右)的纳米粒,体外释药显示具有较好的缓释性和可控性,说明该制备方法具有可操作性及实用性,为青蒿琥酯纳米乳剂制备提供了重要的参考价值,为开发青蒿琥酯新型静脉注射剂型提供了实验依据,具有一定的临床意义。2.体外实验证明Art-NPs具有抑制人白血病K562细胞增殖及促凋亡作用,其效果呈时间-剂量依赖性,随着时间的延长和剂量的增加,抑癌作用显著增加。Art-NPs作用细胞72h后的抑制率超过Art单用组,说明Art-NPs能延长药物对白血病细胞的作用时间,具有缓释作用。3. Art-mPEG-PLGA-NP作为一缓释剂,其药物释放从1～5d逐渐增加,50h之后进入一个相对平缓的释放过程。这一结果表明,Art-mPEG-PLGA-NP随着时间延长,通过不断释放青蒿琥酯,并维持在较高的浓度,从而延长青蒿琥酯对肿瘤细胞的有效作用时间。4.青蒿琥酯纳米粒注射剂进入体内后药物代谢符合房室模型,以骨髓和血液浓聚居多。青蒿琥酯纳米制剂进入体内后仍有部分被单核巨噬细胞系统吞噬,大多聚集在肝脏、脾脏,随着时间推移,肝脏富集减少,但脾脏中仍滞留不少该纳米粒。Art-NPs随着时间延长,血液、骨髓中的浓度相对肝脾来说仍处于较高值,由此说明该新型纳米制剂具有血液及骨髓的靶向性,这就为白血病等血液恶性肿瘤的治疗提供了实验基础,具有一定的临床价值。