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目的:观察葛根素(puerarin,PUE)预处理对内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,e NOS)蛋白表达及磷酸化的影响,以及可能涉及的信号转导通路,探讨其减轻人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)缺氧(Hypoxia,H)/复氧(Reoxygenation,R)损伤的作用机制。方法:SABC法进行HUVECs细胞鉴定后,采用缺氧2小时、4小时、8小时培养后恢复常氧条件培养4小时的方法造成HUVECs缺氧/复氧(H/R)损伤。将HUVECs随机分为正常对照(Control)组、H/R组、单纯PUE组和PUE预处理+H/R组(1.0×10-3 mol/L PUE预处理24 h后进行H/R)。此外,取缺氧4小时/复氧4小时(H4/R4)组,在PUE预处理前分别使用ERK1/2蛋白激酶抑制剂U0126(1.0×10-5 mol/L)、PI3K/Akt蛋白激酶抑制剂LY294002(5.0×10-5 mol/L),处理细胞1 h,再进行H/R,并设立抑制剂单纯用药和溶媒对照组。采用Western blot方法检测e NOS蛋白的表达、e NOS Ser117、Ser633、Thr495磷酸化水平,Akt蛋白和Akt Thr308、Ser473位点的磷酸化水平,ERK1/2蛋白和ERK1/2 Thr202/Tyr204磷酸化水平。化学比色法检测结构型一氧化氮合酶(constitutive NOS,c NOS)的活性。TUNEL法检测细胞凋亡。结果:⑴与Control组相比,H/R组的e NOS蛋白表达明显降低(P<0.05),e NOS Ser1177和Ser633磷酸化水平随e NOS蛋白表达降低相应降低;Akt Thr308和Ser473磷酸化水平,以及ERK1/2 Thr202/Tyr204磷酸化水平均明显降低(P<0.05),c NOS的活力下降(P<0.05);e NOS Thr495、Akt蛋白、ERK1/2蛋白各组间差异无统计学意义。⑵PUE预处理后,与同时间点H/R组相比,e NOS蛋白表达显著升高(P<0.05),e NOS Ser1177、Ser633磷酸化水平随e NOS蛋白表达升高相应升高;Akt Thr308、Ser473及ERK1/2 Thr202/Tyr204磷酸化水平均显著升高(P<0.05),c NOS活力增加(P<0.05),各组间e NOS Thr495、Akt蛋白、ERK1/2蛋白差异无统计学意义。⑶U0126处理后,与PUE+H4/R4组和PUE组比较,U0126+PUE+H4/R4组、U0126+PUE组e NOS蛋白表达和ERK1/2 Thr202/Tyr204磷酸化水平下降(P<0.05)。⑷LY294002处理后,与PUE+H4/R4组和PUE组比较,LY294002+PUE+H4/R4组、LY294002+PUE组e NOS蛋白表达和Akt Thr308、Ser473磷酸化水平降低(P<0.05)。⑸H/R损伤后HUVECs凋亡指数显著升高(P<0.01),PUE预处理后的细胞凋亡指数明显降低(P<0.01)。结论:⑴H/R损伤可引起HUVECs中e NOS蛋白表达降低,酶活性降低,并导致细胞凋亡,从而使内皮细胞受到损伤。⑵PUE预处理可使e NOS蛋白表达增加,酶活性增加,细胞凋亡减少,发挥内皮保护效应。⑶H/R后e NOS蛋白表达的降低可能与ERK1/2、PI3K/Akt信号通路被抑制有关,PUE预处理可通过激活ERK1/2以及PI3K/Akt信号通路上调e NOS蛋白的表达而发挥内皮保护效应。