研究背景和目的： 心脑血管血栓形成占血栓性疾病发病率的第一位，具有极高的病死率和致残率。随着研究的不断深入，血管、血液动力学及血液成分异常凸显出其发病学意义。 本研究着眼于内皮的损伤修复，探讨急性心肌梗死及急性脑梗死患者TF表达的改变；采用新近发展的RNAi技术(RNAinterference，RNAi)针对促凝、致炎的关键基因TF进行干预，设计shRNA，包装成慢病毒，感染人脐静脉血管内皮细胞进行干扰效率的鉴定；感染人脐血内皮祖细胞，进行干扰效率鉴定并对TF基因沉默的EPCs进行生物学特性检测，以期筛选出干扰效率最高、副作用最小的慢病毒，并系统观察细胞不同分化阶段内皮祖细胞、内皮细胞TF表达改变情况；探讨TF基因沉默的内皮祖细胞移植对内毒素血症裸鼠凝血炎症的影响，以期为细胞治疗结合基因治疗在临床心血管疾病的应用提供新思路及理论依据。 方法： 1、急性心肌梗死及脑梗死患者组织因子、组织因子途径抑制物的检测及临床意义： 观察分析69例急性心肌梗死、71例急性脑梗死患者以及50名健康老年人血浆中组织因子、组织因子途径抑制物的表达。TF和TFPI活性测定采用发色底物法，抗原测定用ELISA法。 2、慢病毒携带shRNA对内皮细胞组织因子表达的抑制作用： 利用在线软件设计2个位点的TF干扰序列。采用U6慢病毒表达载体系统构建目标基因TF的慢病毒shRNA表达载体，经测序验证，在293FT细胞中包装病毒粒子，病毒包括3种，目标基因TF的TF6和TF2以及阴性对照TFNC。分别对这3个病毒粒子进行滴度测定。内皮细胞属于诱生性表达TF的细胞，且内皮祖细胞在修复损伤内皮后，也是通过内皮细胞的形式表达其功能，因此，我们采用体外培养的人脐静脉血管内皮细胞进行感染，利用RT-PCR和ELISA方法进行各感染组的TF表达水平检测。 3、TF表达沉默对人内皮祖细胞生物学特性的影响： 密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞，培养7天后，收集贴壁细胞，采用多波长激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-I和Dil-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs：流式细胞仪检测细胞表型：利用RT-PCR、ELISA方法进行各病毒粒子感染EPCs组TF表达水平检测；在有效沉默EPCs表达TF的基础上，MTT比色法检测EPCs的增殖能力，粘附能力实验检测EPCs的粘附能力4、TF表达沉默内皮祖细胞对内毒素血症裸鼠凝血、炎症的影响： 裸鼠内毒素腹腔注射制备内毒素血症模型，尾静脉输入EPCs或TF表达沉默EPCs;7天后，观察动物死亡率：HE染色，观察肺组织炎症病理改变；采血，光镜下计数红细胞、白细胞、血小板数目的改变；血凝仪检测PT、APTT、TT、Fbg的变化；ELISA方法检测TF抗原表达情况；分别分离裸鼠外周血单个核细胞、肝脏细胞及脾脏细胞，抽提基因组DNA，PCR扩增，检测人Alu基因特异性条带。 结果： 1、疾病组(AMI及ACI)与对照组之间除年龄、性别构成比、吸烟及合并糖尿病外均差异显著(P<0.001);AMⅠ组与ACⅠ组二组之间，总胆固醇差异不显著(P=0.073)、低密度脂蛋白差异无统计学意义(P=0.799)，而甘油三酯、高密度脂蛋白二组之间的差异有统计学意义(均P<0.001)。与对照组相比，AMI患者血浆中TF活性、TF抗原、TFPI活性与TFPI抗原均显著增加(P<0.001)；ACI患者血浆中TF活性、TF抗原均升高(P<0.001)，TFPI活性、TFPI抗原均降低(P<0.001)。两病例组相比，AMⅠ组TF活性、抗原升高更为显著(P<0.001)；AMⅠ组TFPI活性、抗原增加，而ACⅠ组均降低，差异具有显著性意义(P<0.001)。 2、根据TF基因(NM001993)，设计、合成2个不同位点的寡核苷酸片断，行95℃退火处理，经4％琼脂糖凝胶电泳检测得到了退火产物dsOligo，将该产物与pENTRTM／U6连接，转TOP10感受态细胞，卡那霉素抗性(50μg/ml)平板筛选阳性克隆，U6前引物(5-GGACTATCATATGCTrACCG-3)测序结果显示获得了阳性克隆。将目标基因阳性克隆质粒与慢病毒载体进行重组，转化Stb13感受态细胞，氨苄青霉素(Amp)抗性筛选后，进行30μg／ml氯霉素的LB平板中的药物负筛选，U6前引物测序再次表明2个位点的重组子均为阳性重组子。将阳性重组子与ViraPowerTM包装质粒混合物在质脂体LipofectamineTM2000的介导下，在293FT细胞中包装病毒，收获含病毒的上清液，-80℃保存。利用系列稀释法(10-2～10-6)测定慢病毒贮液滴度，行杀稻瘟菌素(浓度为10μg/ml)药物筛选，感染的细胞形成肉眼可见的克隆，在显微镜下计数克隆数，测定病毒的滴度为6×105TU／ml(TransducingUnit／ml)。将2个位点的慢病毒和1个阴性对照对人脐静脉血管内皮细胞进行RNAi实验。RT-PCR显示其中TF2位点TF基因表达较低；ELISA分析结果也显示TF2位点TF抗原表达水平也较低，也即TF2位点干扰效果最好。 3、流式细胞仪检测贴壁细胞表面标志，结果显示表达CD133：17.05±2.94％，CD34：12.37±2.69％，KDR：53.84±5.43％。将2个位点的慢病毒和1个阴性对照对人脐血内皮祖细胞进行RNAi实验。RT-PCR显示其中TF2位点TF基因表达较低；ELISA分析结果也显示TF2位点TF抗原表达水平也较低，也即TF2位点干扰效果最好。MTT法观察体外TF2位点、TFNC位点慢病毒感染的EPCs以及单纯EPCs的增殖情况，结果表明三个组EPCs的生长均随时间变化而增长，三个组细胞的增殖能力差异无统计学意义(F=0.036，P=0.965)；粘附能力实验观察体外TF2位点、TFNC位点慢病毒感染的EPCs以及单纯EPCs的粘附能力，结果表明三个组EPCs的粘附能力均随时间变化而增加，三个组细胞的粘附能力差异无统计学意义(F=0.067，P=0.936). 4、注射内毒素12小时后，即有动物开始死亡，至7日，三个模型组共死亡17只，其中LPS组死亡最多，死亡7只，LPS+EPCs组死亡6只，TF表达沉默的LPS+EPCs+TF2组死亡数最少，死亡4只；人EPCs移植裸鼠后，人源细胞能分布到裸鼠的各个组织，包括外周血、肝脏和脾脏；对肺组织病理学检查发现，模型LPS组动物肺泡结构紊乱，肺间隔明显增厚，肺泡腔内、肺泡间隔大量炎性细胞浸润，支气管上皮细胞脱落，呈现明显的炎症反应特征；EPCs移植均能降低LPS引起的肺部炎症反应，但TF表达沉默的EPCs移植组，炎症反应较单纯的EPCs移植组炎症反应更轻，肺泡结构改变也更小；三个模型组之间红细胞、白细胞、血小板数目均降低，显著低于对照组(P<0.05)，但模型组之间差异不显著(P>0.05)；三个模型组PT、APTT、TT均延长，显著高于对照组(P<0.01)，三个模型组之间PT、APTT、TT差异不显著(P>0.05)；三个模型组Flag含量降低，显著低于对照组(P<0.01)，三个模型组之间Fbg差异不显著(P>0.05)；LPS可引起模型组TF抗原含量升高，EPCs移植可降低模型TF抗原含量，且TF沉默EPCs比单纯EPCs降低模型TF的效果更好(P=0.011). 结论： 1、急性心肌梗死和急性脑梗死患者均存在组织因子表达增高，且其组织因子途径改变并不相同，患者血栓形成风险增加，测定TF、TFPI对了解疾病发展趋势具有辅助作用。 2、成功地构建了人TF基因RNAi慢病毒载体，克隆出TF2、TF6和TFNC三个干扰载体，进行慢病毒的包装和滴度测定，RT-PCR、ELISA显示其中TF2位点TF干扰效果最好。 3、成功分离、鉴定了人脐血内皮祖细胞，发现用TF2位点的慢病毒感染EPCs，其TF干扰效果最好；用TF2及TFNC位点的慢病毒感染EPCs不影响体外EPCs增殖能力、细胞粘附能力，提示TF表达沉默的EPCs有望成为既降低TF表达也参与内皮损伤修复的一种全新基因修饰的细胞治疗载体。 4、输入EPCs或TF表达沉默的EPCs对全身系统性凝血功能没有明显影响，但TF表达沉默的EPCs降低内毒素血症模型肺部炎症反应并降低TF抗原含量的作用要明显优于对照EPCs，有望弥补单用EPCs移植不能阻断或减缓体内凝血、炎症过程发展的不足。 主要创新点： 1、血浆中TF的表达与动脉粥样硬化、脓毒血症和DIC等许多病理过程密切相关，由于其在凝血途径中的启动效应，“上游”阻断比“下游”阻断理论上更具有优势，对这些疾病的预防和治疗有着非常重要的临床意义。 2、首次利用慢病毒载体的方法，系统观察细胞不同分化阶段内皮细胞、内皮祖细胞TF基因的RNAi实验，为体内外抗凝、抗炎机制研究提供实验手断。 3、利用RNAi技术沉默人TF基因，获得了一个新的TF基因沉默的有效位点，为RNAi数据库提供了新的有效作用位点。 4、初步将细胞治疗与基因治疗相结合应用于血栓栓塞性疾病的防治，目前国内外尚未见类似报道，为进一步应用TF沉默的EPCs的体内试验研究进行了有益的探索。