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目的:肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,也是癌症相关死亡的主要原因,其中腺癌是主要的病理亚型。在肺腺癌患者中,经常观察到EGFR突变,例如第19外显子的框内缺失和第21外显子的858位密码子内的核苷酸取代。对于具有EGFR致敏突变的肺腺癌患者,EGFR-TKIs药物埃克替尼等已普遍用于一线治疗。不幸的是,大多数治疗有效患者最终会在10-16个月内获得EGFR-TKI耐药。因此,EGFR-TKIs耐药是治疗具有EGFR敏感突变的肺腺癌患者的主要障碍。尽管目前已经揭示了一些诱导EGFR-TKIs耐药的分子机制,包括MET或ERBB2基因扩增和T790M突变等,但其他潜在的耐药机制尚不清楚。长链非编码RNA（lncRNA）是一类新型的转录本,缺乏蛋白质编码的潜力,大小超过200个核苷酸,涉及表观遗传、转录,转录后翻译调控,以及翻译后修饰。定位于细胞质中的lncRNA通常起竞争内源性RNA（ceRNA）的作用,在转录后水平发挥其调节功能。最近,有研究证明lncRNA在调节癌症发展和生物学进程中起关键作用。也有研究还表明,lncRNA也参与了耐药的调控。然而,大多数与EGFR-TKI耐药相关的lncRNA及其功能机制仍然未知。在本研究中,使用转录组测序和差异LncRNA表达分析筛选了埃克替尼肺腺癌细胞中的lncRNA,并鉴定了一种新的耐药相关的lncRNA APCDD1L-AS1（ENSG00000231290）。进一步的研究表明,APCDD1L-AS1可以吸附miR-1322/miR-1972/miR-324-3p上调SIRT5的表达来促进肺腺癌细胞埃克替尼耐药。最后,SIRT5通过抑制EGFR的自噬降解,增强EGFR表达并激活EGFR磷酸化,诱导肺腺癌细胞埃克替尼耐药。这项研究发现了lncRNA参与了埃克替尼耐药的新机制,即APCDD1L-AS1可以通miR-1322/miR-1972/miR-324-3p/SIRT5轴抑制EGFR的自噬降解从而促进埃克替尼耐药。因此,它进一步阐明了APCDD1L-AS1,miR-1322,miR-1972,miR-324-3p和SIRT5可以作为有希望的耐药标志物,为克服埃克替尼耐药提供新的靶标。研究方法:1、使用转录组测序和对肺腺癌耐药细胞及其亲代细胞的lncRNA表达差异分析,筛选了确定了lncRNA APCDD1L-AS1,并且qRT-PCR验证了其表达。2、荧光原位杂交（FISH）和核/质RNA分离实验确定了APCDD1L-AS1的细胞定位。3、双荧光素酶报告基因测定和RNA免疫共沉淀（RIP）证实了APCDD1L-AS1,miR-1322/miR-1972/miR-324-3p和SIRT5构成ceRNA网络。4、qRT-PCR的结果评估了miR-1322/miR-1972/miR-324-3p和SIRT5在肺腺癌埃克替尼耐药细胞及其亲代细胞中的表达。5、流式细胞技术和western blot实验明确了APCDD1L-AS1-KD和SIRT5-KD肺腺癌耐药细胞凋亡情况。6、MTT实验结果显示APCDD1L-AS1-KD、miR-1322/miR-1972/miR-324-3p mimics和SIRT5-KD肺腺癌耐药细胞对埃克替尼敏感性。7、通过western blot和免疫荧光染色在体内和体外观察SIRT5对EGFR表达和自噬的影响。8、免疫组织化学染色显示转染Lv-sh RNA-APCDD1L-AS1病毒组的SIRT5和EGFR表达情况。结果:1、APCDD1L-AS1在肺腺癌耐药细胞中显著上调。为了筛选与埃克替尼有关的lncRNA,在PC9,PC9/Ico RL和PC9/Ico RH细胞中进行了lncRNA的整体表达谱分析。qRT-PCR也证实了相似的结果。2、APCDD1L-AS1在肺腺癌耐药细胞中促进EGFR上调,抑制细胞凋亡促进耐药。MTT和western blot结果表明APCDD1L-AS1-KD在肺腺癌耐药细胞中显著增强了其对埃克替尼的敏感性,并降低了EGFR的蛋白和磷酸化水平,而APCDD1L-AS1-OE则增加了EGFR的表达和磷酸化水平。另外,流式细胞术和western blot的结果证实,APCDD1L-AS1-KD促进了埃克替尼诱导肺腺癌耐药细胞凋亡。3、Mi R1322/miR1972/miR324-3p抑制EGFR表达,促进细胞凋亡,增加肺腺癌耐药细胞对埃克替尼的敏感性。将miR-1322,miR-1972和miR-324-3p的mimics分别转染到肺腺癌耐药细胞中,然后给予埃克替尼icotinb处理。结果表明miR-1322/miR-1972/miR-324-3p mimics均显著增强了埃克替尼的敏感性。同时降低了EGFR的蛋白表达和磷酸化水平,促进了肺腺癌细胞凋亡。4、APCDD1L-AS1通过吸附miR1322/miR1972/miR324-3p上调SIRT5表达。双荧光素酶报告和RIP检测表明,APCDD1L-AS1能够吸附miR-1322/miR-1972/miR-324-3p。qRT-PCR和Western blot结果表明,SIRT5的m RNA和蛋白表达水平均被APCDD1L-AS1-KD降低,但被APCDD1L-AS1-OE升高。此外,APCDD1L-AS1-KD还抑制EGFR表达及其磷酸化,部分被miR-1322,miR-1972和miR-324-3p inhibitor挽救。5、SIRT5在肺腺癌耐药细胞中促进EGFR上调,抑制细胞凋亡,诱导耐药。MTT分析表明,SIRT5-KD显著增加了肺腺癌耐药细胞对埃克替尼的敏感性。同时,SIRT5-KD耐药细胞中EGFR的蛋白表达和磷酸化水平显著降低。此外,流式细胞仪和western blot的结果表明,SIRT5-KD显著增加了肺腺癌耐药细胞的凋亡比例。6、SIRT5通过抑制其自噬降解上调EGFR表达。Western blot结果显示,SIRT5-KD肺腺癌耐药细胞中p62的表达降低,而LC3B-Ⅱ的表达增加。给予两种自噬抑制剂CQ和3-MA可以部分挽救SIRT5-KD诱导的EGFR降解,EGFR激活的抑制和PARP表达的增加。相反,自噬激活剂雷帕霉素可部分逆转肺腺癌细胞对埃克替尼的耐药性。7、APCDD1L-AS1通过miR1322/miR1972/miR324-3p-SIRT5轴抑制EGFR自噬性降解,诱导耐药。Western blot的结果表明,APCDD1L-AS1-KD抑制EGFR表达及其激活,并促进自噬,但部分被miR-1322,miR-1972和miR-324-3p的inhibitor所回复。裸鼠皮下成瘤体内实验结果证明了与体外实验结果是一致的。结论:1、与耐药相关的新lncRNA APCDD1L-AS1促进了肺腺癌细胞对埃克替尼耐药。2、APCDD1L-AS1通过吸附miR1322/miR1972/miR324-3p上调SIRT5和EGFR表达,抑制细胞凋亡,诱导耐药。3、SIRT5通过抑制EGFR的自噬降解促进肺腺癌细胞对埃克替尼耐药,而给予自噬激活剂雷帕霉素可完美逆转肺腺癌细胞对埃克替尼耐药。4、APCDD1L-AS1通过miR-1322/miR-1972/miR-324-3p-SIRT5轴抑制EGFR的自噬降解,从而诱导肺腺癌细胞对埃克替尼耐药。