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十二指肠贾第鞭毛虫（简称贾第虫）是一种有鞭毛的原生单细胞生物。贾第虫感染性包囊可能存在于粪便、污染的水、食物等物质中,经口感染人类或其他动物。作为一种非侵入性的原生动物寄生虫,贾第虫可定殖在人类的小肠,每年会导致2.8亿人感染贾第虫病。已有研究表明,贾第虫滋养体或其分泌蛋白可以引起肠上皮细胞凋亡的发生,而肠上皮细胞凋亡正是引起贾第虫病症状的主要原因。有关于贾第虫引起肠上皮细胞凋亡以及细胞抵御该寄生虫的分子机制仍不清晰。本研究建立了贾第虫与三种肠上皮细胞的体外作用模型,进一步揭示了贾第虫感染时引起肠上皮细胞凋亡的机制以及宿主细胞的抗凋亡机制,为进一步了解贾第虫病的发病机制以及寻找新的贾第虫病治疗方案提供有效的参考。在贾第虫刺激肠上皮细胞（Caco-2细胞和HT-29细胞）时,通过收集细胞并提取RNA以及蛋白进行荧光定量PCR（q PCR）和Western blot实验分析发现肠上皮细胞在贾第虫感染时会引起环氧合酶-2（COX-2）转录以及蛋白水平的升高。病原体感染常会引起COX-2表达升高,COX-2可以参与免疫应答,但其在宿主防御贾第虫感染中的作用尚不清楚。通过CCK-8实验发现,利用COX-2抑制剂处理会加剧贾第虫刺激引起的细胞凋亡水平。通过荧光显微镜和荧光酶标仪的检测可以得出,抑制COX-2会加剧贾第虫刺激引起的细胞ROS水平升高。高ROS水平不利于细胞的正常生理功能。利用Griess Reagent检测细胞培养液中的硝酸亚以及亚硝酸盐水平代表细胞释放的一氧化氮（NO）水平,结果显示贾第虫刺激会导致细胞释放NO的量降低,而抑制COX-2会导致NO的释放量进一步降低。肠上皮细胞吸收精氨酸并释放NO为自身提供能量,培养液中精氨酸被贾第虫竞争性利用会导致肠上皮细胞凋亡。利用AO/EB双染色试剂对活细胞以及凋亡细胞进行染色并通过荧光显微镜进行观察分析,结果显示抑制COX-2会加剧贾第虫刺激引起的细胞凋亡,而过表达COX-2会缓解凋亡现象的发生。利用Western blot实验分析COX-2的表达对凋亡相关蛋白的影响,结果显示抑制COX-2会加剧贾第虫刺激引起的caspase3（CASP3）和PARP的剪切活化,进一步降低抗凋亡蛋白c IAP-2和survivin的表达,而过表达COX-2会缓解以上现象。Western blot实验结果显示,贾第虫刺激会引起肠上皮细胞MAPK通路的p38和ERK磷酸化以及AKT的磷酸化增加,表明其相关通路在此过程中被激活。利用TLR4抑制剂TAK-242、p38抑制剂SB202190、ERK抑制剂SCH772984,AKT抑制剂MK-2206 2HCl处理细胞检测以上四种因素对COX-2蛋白表达的影响,结果显示,对TLR4、p38、ERK以及AKT的抑制均会降低贾第虫刺激引起的COX-2表达增加,抑制TLR4还会降低细胞因为贾第虫刺激引起的p38磷酸化水平增加。利用荧光酶标仪检测发现,除了抑制TLR4会缓解贾第虫刺激引起的ROS水平升高,抑制p38、ERK以及AKT均会导致贾第虫刺激引起的ROS水平进一步升高。AO/EB双染色实验结果显示,TLR4、p38、ERK以及AKT的抑制均会加剧由贾第虫刺激引起的细胞凋亡。Western blot实验结果显示,抑制TLR4、p38、ERK以及AKT均会导致贾第虫刺激引起的CASP3和PARP的剪切活化水平升高,抗凋亡蛋白c IAP-2和survivin的表达降低。利用间接免疫荧光的方法检测贾第虫刺激时肠上皮细胞中NF-κB p65的定位,荧光显微镜结果显示,贾第虫刺激会导致肠上皮细胞中NF-κB p65从细胞质向细胞核转移。Western blot实验结果也显示贾第虫刺激会导致细胞核中NF-κB p65含量增加。利用JSH-23抑制细胞质中NF-κB向细胞核转移后再用贾第虫刺激肠上皮细胞,收集蛋白样品进行Western blot实验结果显示抑制NF-κB向细胞核转移会降低贾第虫刺激时细胞中COX-2的表达。分析荧光酶标仪的结果显示,抑制NF-κB向细胞核转移也会增加贾第虫刺激时细胞ROS水平。利用Griess Reagent检测细胞培养液中的硝酸亚以及亚硝酸盐水平代表细胞释放的NO水平,结果显示抑制NF-κB向细胞核转移会进一步加剧贾第虫刺激引起NO释放水平降低。AO/EB双染色结果显示,抑制NF-κB向细胞核转移也会加剧细胞凋亡。Western blot实验结果也显示抑制NF-κB向细胞核转移会增加贾第虫刺激导致的CASP3和PARP的剪切活化,降低c IAP-2和survivin表达水平。Western blot和间接免疫荧光实验结果显示,抑制TLR4和p38均可以阻碍贾第虫刺激导致的NF-κB向细胞核转移。本研究确定COX-2在贾第虫滋养体感染的肠上皮细胞中潜在的抗凋亡功能,探讨了调控COX-2表达、ROS/NO生成和肠上皮细胞凋亡的可能信号转导机制,并试图揭示其中的相互关系。在贾第虫、分泌蛋白或纯化蛋白与肠上皮细胞（Caco-2和LS174细胞）互作模型中,发现贾第虫的刺激能够引起内质网应激标志蛋白GRP78在转录和蛋白水平上调表达,并激活PERK受体,导致e IF2α磷酸化,促进ATF-4表达上调,激活PERK/e IF2α/ATF-4/CHOP通路。q PCR结果显示,贾第虫的刺激会导致肠上皮细胞中多种伴侣蛋白转录水平升高。荧光显微镜和荧光酶标仪结果显示,贾第虫刺激会诱导LS174细胞ROS水平升高,而Western blot实验结果显示,当用ROS抑制剂NAC处理细胞后会缓解贾第虫刺激导致的GRP78和CHOP水平以及p38磷酸化水平升高,并抑制PERK/e IF2α/ATF-4通路激活。当用p38抑制剂SB202190预处理细胞后,也可以缓解GRP78/PERK/e IF2α/ATF-4通路激活。利用Fluo-4探针检测细胞内的钙离子(Ca2+)水平,荧光显微镜和荧光酶标仪结果显示贾第虫刺激会导致细胞内Ca2+水平升高。利用细胞内Ca2+螯合剂以及内质网Ca2+泵抑制剂预处理细胞,再用Western blot实验检测细胞内质网应激水平,结果显示内质网Ca2+泵抑制剂会缓解贾第虫刺激导致的GRP78/PERK/e IF2α/ATF-4/CHOP通路激活。q PCR结果显示,用TLR4抑制剂TAK-242预处理细胞会缓解贾第虫刺激引起的伴侣蛋白表达的上调。Western blot实验结果显示,TLR4抑制剂预处理也可以缓解贾第虫刺激诱导的GRP78/PERK/e IF2α/ATF-4通路激活。TLR4抑制剂预处理还可以缓解贾第虫刺激导致的ROS水平升高。CCK-8与AO/EB双染色实验结果显示,抑制TLR4会加剧贾第虫感染导致的细胞活性降低和加重细胞凋亡。Griess Reagent法检测显示,利用si RNA技术抑制CHOP转录会缓解贾第虫刺激引起的细胞NO水平降低,抑制TLR4/ROS/p38会加剧NO释放量降低,而抑制内质网Ca2+泵会缓解贾第虫刺激引起的细胞NO水平降低,额外补充精氨酸可以缓解NO水平降低。利用LPS提前诱导细胞i NOS表达,再用相关抑制剂探究TLR4/ROS/p38/Ca2+/CHOP对i NOS转录水平影响,q PCR结果显示,抑制内质网Ca2+泵或CHOP会缓解贾第虫刺激导致的i NOS转录水平的降低,而抑制TLR4/ROS/p38会使i NOS转录水平进一步下降。CCK-8结果显示,抑制ROS/CHOP或内质网Ca2+泵可以缓解贾第虫刺激引起的细胞活性下降,而抑制TLR4/p38会使贾第虫刺激的细胞活性进一步降低。Western blot实验结果显示,抑制ROS/CHOP或内质网Ca2+泵可以缓解贾第虫刺激引起的c IAP-2和survivin表达水平降低和细胞内源性凋亡,而抑制TLR4/p38会加剧以上现象。实验证明贾第虫分泌蛋白刺激肠上皮细胞也可以引起内质网应激并激活GRP78/PERK/e IF2α/ATF-4/CHOP通路,抑制TLR4/ROS/p38或内质网Ca2+泵均可以缓解内质网应激水平。贾第虫分泌蛋白会导致肠上皮细胞活性降低,诱发细胞凋亡。本研究体外表达纯化10种贾第虫分泌蛋白（吡哆胺5’磷酸氧化酶、肽基—脯氨酰顺反异构酶B（peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B,PPIB）、2种粘韧素和6种组织蛋白酶B）。经过q PCR以及Western blot方法的筛选,发现重组蛋白PPIB可以引起肠上皮细胞GRP78/PERK/e IF2α/ATF-4/CHOP通路的激活,抑制TLR4/ROS/p38可以缓解PPIB刺激引起的内质网应激,然而在12 h内未发现PPIB刺激可以引起细胞凋亡发生。综上所述,本研究首次发现了贾第虫刺激会引起肠上皮细胞COX-2表达水平的升高,COX-2参与宿主细胞对贾第虫引起的细胞凋亡的抵抗。COX-2介导的抗凋亡过程被证实是由MAPK/AKT信号通路或TLR4依赖的p38-NF-κB信号通路调控的。在这里,ROS/NO的水平会受到MAPK/AKT/NF-κB信号控制的COX-2影响。另一方面,贾第虫刺激会诱导肠上皮细胞内质网应激的发生,内质网应激会引起细胞凋亡。在影响内质网应激的潜在机制方面,TLR4/ROS/p38以及内质网内的Ca2+均可以影响GRP78/PERK/e IF2α/ATF-4通路。贾第虫分泌蛋白PPIB也可以引起肠上皮细胞的内质网应激,其潜在影响还需继续研究。该研究不仅为贾第虫病致病机制和宿主抵御贾第虫感染的免疫机制提供了新的证据,也为临床上防治贾第虫病提供了新的思路。