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蛋白酶是可以催化蛋白质水解的一类酶,广泛应用在食品加工、制革、饲料、医药保健品及功能多肽制备等行业上。蛋白质的蛋白酶水解产物中具有生物活性的功能多肽,如抗氧化肽、抗高血压肽等,相关多肽在食品添加、保健品等行业中有重要的应用价值。课题组前期获得了一株高产的重组米曲霉中性蛋白酶(r Np I)菌株,该蛋白酶对植物蛋白等底物具有很高的水解活性。为进一步探讨重组米曲霉中性蛋白酶r Np I对大豆、花生等植物蛋白及酪蛋白的水解活性、水解产物肽分子量的分布、水解产物苦味评价,水解多肽的清除DPPH能力、还原能力、氧自由基清除能力(ORAC)及体外血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性等性质,本论文展开了相关的研究。结果表明r Np I对植物及动物蛋白具有较高的水解活性。以大豆蛋白为例,当酶与底物比(E/S)为1000 U/g、4000 U/g、8000 U/g时,水解度分别为7.8%、11.5%和16.0%。对大豆蛋白水解产物进行苦味评价,结果发现r Np I水解产物的苦味值明显比商业如蛋白酶碱性蛋白酶(Alcalase)的水解产物低。高效液相色谱法(HPLC)对大豆蛋白水解产物测定结果显示,当E/S为8000 U/g时,小于1 k Da的组分占44.02%,表明r Np I的大豆蛋白水解产物中小分子肽占了较大的比例。在鲫鱼饲料添加养殖实验结果也表明,添加r Np I可降低5.5%的菜粕及5%的小麦添加,饲料饵料系数(feed conversation rate,FCR)降低了7.2%。不同的体外抗氧化方法测定r Np I大豆蛋白水解产物的抗氧化活性测定表明,该水解产物具有较高的清除DPPH自由基能力、还原能力和氧自由基清除能力。E/S为4000 U/g时,水解产物的DPPH自由基能力为80.1%,还原力为0.34,ORAC值为455μmol TE/g protein。通过超滤的方法对E/S为4000 U/g的水解产物进行分离,得到分子量>10 k Da、3-10 k Da和<3 k Da的组分,分别测定其抗氧化性,结果表明,SPIH-I(分子量大于10 k Da组分)具有最高的DPPH自由基清除能力(82.7%),SPIH-III(分子量小于3 k Da的组分)具有最大的ORAC值(722μmol TE/g protein)。体外ACE抑制活性的测定结果显示当r Np I与大豆蛋白E/S分别为1000、4000和8000 U/g时,对应的ACE半抑制浓度(IC50)值分别为452.69μg/ml、136.93μg/ml和84.48μg/ml,表明r Np I的大豆蛋白水解产物具有较高ACE抑制活性。综上所述r Np I对植物及动物蛋白有很高的水解效率,其水解产物苦味值低;水产动物养殖实验表明该中性蛋白酶酶适合在水产动物饲料中添加;该酶的水解产物具有较高的抗氧化性及血管紧张素转化酶抑制活性。相关结果表明该中性蛋白酶在食品蛋白水解、饲料添加、食品保藏、保健品等行业有很好的应用前景。