背景:胰腺癌的发病率逐年上升，由于其早期临床症状不明显，80﹪患者确诊时属于晚期，而化疗是晚期胰腺癌的主要治疗手段。 目前吉西他滨单药是晚期胰腺癌的标准的一线化疗方案，但其中位生存期仅5.4-5.6个月，1年生存率仅为16﹪-19﹪，疗效较差。 胰腺癌化疗失败的丰要原因之一是胰腺癌细胞的多药耐药，多药耐药是指肿瘤细胞接触某一种抗癌药物的同时，对其他结构和功能不同的药物产生耐药。吉西他滨化疗失败的原因也是胰腺癌细胞在化疗过程中产生了耐药现象，作为胰腺癌化疗的一线用药，探讨其耐药机制显的十分重要。 细胞膜糖蛋白p-gp是多药耐药基因mdr-1的表达产物。P-gp为一能量依赖的单向药物外排泵，可将进入细胞内的药物排出细胞外，由此引起的细胞内药物积聚减少是MDR的主要原因。多数肿瘤细胞膜上可检测到p-gp的过度表达，在正常胰腺细胞中检测到p-gp的表达为33﹪，而胰腺癌细胞中p-gp的表达高至71﹪，因此胰腺癌被认为是天然耐药的肿瘤之一。要洁等研究表明胰腺癌耐吉西他滨细胞株中mdr-1的表达较其亲本细胞升高。 吉西他滨是细胞周期特异性抗代谢药物，它在体内由脱氧胞苷激酶(dCK酶)代谢为其活性产物---吉西他滨二磷酸盐(dFdCDP)和吉西他滨三磷酸盐(dFdCTP)，从而发挥抗肿瘤作用的。RR有两个亚基组成-RRM1和RRM2，其中RRM1是核苷酸结合位点，控制底物的特异性和整个酶的活性，同时也是核昔类似物系的化疗药物的结合位点。多项研究发现，当吉西他滨作为一种影响因素作用于肿瘤细胞时，RRM1表达水平增高会使肿瘤细胞对化疗药的耐药性增加。近来的几项研究也表明在耐吉西他滨胰腺癌细胞中RRMl的表达升高，可能是导致胰腺癌耐吉西他滨的一个重要因素。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kirlase MAPK)家族是信号传导中最主要的成分，可将不同的细胞外信息转化为细胞内反应。细胞外信号调节激酶(ERK)是有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族的一个亚组，可被许多细胞因子和生长因子激活，介导细胞增殖，分化等信号传导。ERK1和ERK2是其中的两个重要成员，它们所参与的信号传导与肿瘤的发生，发展有关。有体外和动物实验证明ERK通路的激活不仅与胰腺癌的发生有关，并且ERK的过度激活与肿瘤化疗的耐药相关，其机制可能是通过上调肿瘤耐药相关基因的表达。赵玉沛等发现在胰腺癌耐药细胞株中，ERK蛋白明显升高，并且使用ERK通路阻断剂后，细胞的耐药会得到部分逆转，因此推测ERK通路可能参与了胰腺癌细胞耐药形成。 由以上理论，mdr-1基因编码的p-gp蛋白可以改变细胞内药物的分布，而RRMl又是吉西他滨的作用靶点，是吉西他滨特异性结合位点，ERK通路又可能参与了胰腺癌细胞的耐吉西他滨的过程，我们设想是否ERK通路调节胰腺癌细胞耐吉西他滨的形成是通过mdr-1、RRM1的表达升高而实现的。理论上来讲，此观点是行的通的，ERK通路参与了胰腺癌耐吉西他滨的过程，而胰腺癌形成耐药的过程与药物的分布及代谢情况密切相关，p-gp与RRM1分别是决定药物分布与代谢的两个重要因素。近来有研究表明ERK通路与mdr-1基因之间可能存在着关联，即ERK通路可能是通过调节mdr-1基因而改变化疗药物的敏感性的，但这一实验是在胃癌细胞中进行的，目前在胰腺癌中尚无相关报道。目前国内外尚无同样研究，本实验初步探讨了ERK通路与胰腺癌细胞耐吉西他滨的机制之问的内在联系，并且与临床实践中的难点相结合的，具有一定的科研及临床价值。 目的:通过建立胰腺癌细胞吉西他滨化疗抵抗模型，动态检测不同药物浓度下ERK、 mdr-1、RRM1的表达情况，并分别用ERK通路的激活剂与阻断剂作用，观察它们三者的变化趋势，初步探讨胰腺癌细胞吉西他滨化疗抵抗的可能机制。 材料和方法: 1 细胞和免疫细胞化学方法胰腺癌细胞株由中山大学动物中心提供。将洁净的载玻片置于6孔培养板，细胞消化后以一定细胞数接种于6孔培养板，置于含5﹪CO<,2>、37℃细胞培养箱中培养24h。吸去上层培养基，固定细胞，风干。进行免疫SP法染色。 2 细胞培养和药物处理胰腺癌细胞株SW1990用含GEM的RPMI1640培养基(含10﹪胎牛血清，GEM在培养基中的终浓度分别为0、30、60、100、150、200nmol/l)，置于含5﹪CO<,2>、37℃细胞培养箱中培养。 实验分组：吉西他滨单药组(简称GEM组)、GEM+U0126组、GEM+EGF组。 3 MTT法检测各实验组中胰腺癌细胞的增殖抑制作用及IC50。 以4X10<'4>个细胞/孔接种于96孔培养板上，24小时后换不同浓度、不同种类药物的培养基，分别作用24、48、72小时后酶标仪检测OD492光密度值。 细胞的相对抑制率(Inhibition rate，IR)由以下公式计算： IR=(1-药物组OD值/对照组OD值)×1000﹪ 通过对细胞的抑制率求出相应各组的IC50。 4 统计分析 免疫组化图片用image pro-plus软件进行半定量分析(其中ERK灰度值与ERK蛋白表达成反比关系)，RT-PCR结果使用Band凝胶软件进行半定量分析，结果的数据统计分析使用SPSS 10.0软件完成，对相关指标进行线性相关分析，并对MTT结果进行分析，计算IC50值。 结果: 1.建立的GEM化疗抵抗胰腺癌细胞株模型经过浓度梯度递增法诱导的胰腺癌GEM化疗抵抗细胞株，细胞可以在GEM终浓度为0、30、60、100、150、200nmol/l的培养基中稳定生长并传代，这种方法与临床化疗耐药的过程十分接近，是一种十分接近临床肿瘤化疗后产生耐药的方法，对于探讨临床肿瘤化疗后耐药的机理更有意义。 2.不同GEM浓度化疗抵抗的胰腺癌细胞株中ERK、mdr-1、RRM1基因的表达随着GEM浓度的提高，ERK、 mdr-1、RRM1的表达也同步升高，进行统计分析，GEM浓度/mdr-1、GEM浓度/RRM1、ERK/mdr-1、ERK/RRM1之间均存在高度相关性，其相关系数分别为0.960、0.966、-0.943、-0.883，并都取得了统计学意义。 3.使用阻断剂、激活剂后三者的表达情况0nmol/l浓度的GEM化疗抵抗细胞株，用ERK通路阻断剂作用于后，细胞株的ERK灰度值由248.28±11.03上升为283.17±12.45、mdr-l表达由0.81±0.07下降为0.2±0.01、RRM1的表达由1.27±0.06下降为0.25±0.02；200nmol/l浓度的GEM化疗抵抗细胞株用ERK通路阻断剂作用于后，细胞株的ERK灰度值由164.22±13.17上升为186.85±13.14，mdr-1表达由1.41±0.04下降为0.23±0.02，RRM1的表达由1.45±0.18下降为0.21±0.03。而0nmol/l浓度的GEM化疗抵抗细胞株在经过EGF作用后，细胞株的ERK灰度值由248.28±11.03下降为116.35±16.13、mdr-1表达由0.81±0.07上升为1.22±0.05、RRM1的表达由1.27±0.06上升为1.35±0.06；200nmol/l浓度的GEM化疗抵抗细胞株在经过EGF作用后，细胞株的ERK灰度值由164.22±13.17下降为106.55±16.45，mdr-1表达由1.41±0.04上升为1.5±0.07，RRM1的表达由1.45±0.18上升为1.52±0.12。由于ERK蛋白灰度与表达成反比，因此由以上数据ERK、mdr-1、RRMl三者呈现ERK通路阻断后同步降低，ERK通路激活后同步升高的趋势。 4.MTT法测IC50值随着GEM化疗抵抗的浓度由0nmol/l升高到200nmol.l，其IC50值也由4.104增加到10.2，经U0126处理后，0nmol/l的IC50值由4.104下降到3.26，200nmol/l的IC50值由10.2下降到4.5。经EGF处理后，0nmol/l的IC50值由4.104上升到8.89，200nmol/l的IC50值由10.2上升到17.17。 结论: 1.mdr-1、RRM1基因的表达上调可导致胰腺癌细胞GEM化疗抵抗。 2.ERK通路参与调控RRM1、mdr-1基因的表达。 综上所述，胰腺癌细胞GEM化疗抵抗过程中有ERK通路的参与，ERK通路可能是通过调控mdr-1、RRM1基因表达而起作用的，ERK通路可能作为一个治疗胰腺癌GEM化疗抵抗的新靶点。