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背景：
妊娠20周前自然流产连续发生2次或2次以上称为复发性流产(Recurrent spontaneous abortion, RSA)，根据世界卫生组织(WHO)的估计发病率约占临床公认妊娠的15%，不仅严重影响到全世界大约5%的育龄妇女生殖健康，同时也严重影响到育龄妇女心理健康。我国二胎政策的放开以及女性晚育率的升高致使RSA发病率大幅度上升。多年来研究人员试图确定RSA的发病机制，然而，除了已知的致病因素包括染色体异常、内分泌因素、解剖、感染和免疫功能障碍外，约50%RSA病例的病因仍未能解释，称为不明原因复发流产(Unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)。URSA不仅严重影响妇女生殖健康，也给患者和家庭带来巨大压力，其诊断与防治已成为生殖医学领域亟待解决的难题。胚胎携带父方组织相容性抗原，相对于母体犹如半同种异体移植，但正常情况下并未受到母体的免疫排斥，而是能够在母体内正常生长发育直至分娩，母胎免疫耐受在其中发挥着重要的作用。如果母胎免疫耐受状态失衡，将导致流产发生。
树突状细胞(Dendritic cell，DC)是体内唯一能够活化初始T细胞的抗原提呈细胞(Antigen presenting cell，APC)，能够识别、获取、加工抗原，并将MHC-抗原复合物提呈给T细胞(T lymphocyte，T cell)使其活化、增殖和分化，在抵抗病原微生物感染、维持机体内环境稳定中发挥着关键作用。DC可以分为经典DC(cDC)及浆细胞样DC(pDC)，cDC具有强大的抗原提呈功能，而pDC通过分泌IL-10、TGF-β等细胞因子诱导T细胞向Th2、Treg亚群分化，在诱导机体免疫耐受中发挥作用。研究证实人类蜕膜组织中存在DC，且与大量集簇的T细胞紧密相邻，并且发现DC在妊娠维持过程中具有重要作用。我们前期研究证实URSA患者及模型小鼠存在DC亚群偏移，pDC比例减少，但导致这一现象的原因尚不清楚，从而限制了调控DC诱导母胎免疫耐受治疗URSA方法与药物的发掘。
随着对DC发育分化研究的不断深入，发现酪氨酸激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)信号通路是调控DC发育分化的关键通路。其中，转录激活蛋白3(STAT3)是此信号通路关键分子，对pDC分化发育具有重要调控作用。但URSA患者中pDC下调是否与STAT3有关，及STAT3上游调控机制尚不明确，此方面的深入研究将进一步揭示URSA中pDC分化失衡的根源，为临床治疗提供新的靶点和途径。
随着人类基因组计划的完成及DNA元素百科全书计划的启动和推进，使得非编码RNA表观遗传调控生命活动及疾病发生发展的研究成为医学领域的新热点。目前对URSA的研究发现，染色体异常仅占3%～5%，我们不禁推测非编码RNA表观遗传机制可能在URSA母胎免疫耐受失衡中扮演了重要角色。微小核糖核酸(MicroRNA， miRNA)是一类长约20-24个核苷酸的非编码RNA，对靶基因起调控作用，参与机体大多数生命过程。现已发现miRNAs大量表达于人的血液、蜕膜、绒毛中，并且URSA患者miRNAs表达与正常妊娠妇女具有显著差异，miRNAs表达失调与RSA的发病机制密切相关，但尚未见miRNA调控pDC分化影响母胎免疫耐受机制的研究报道。此方向的深入研究有望从表观遗传免疫调控方向揭示URSA发病原因，为临床治疗URSA提供新方向。
目的：
探讨微小RNA-6165(miRNA-6165)调控STAT3信号通路干预pDC亚群分化与功能在URSA中的作用与关键机制,从表观遗传免疫调控方向揭示URSA发病原因，为临床治疗提供理论依据。
方法：
选取正常早孕妇女(正常妊娠组)和URSA患者(URSA组)各30例，空腹抽取静脉血，分离单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，流式细胞术检测pDC比例；q-PCR法检测STAT3mRNA表达水平；WesternBlot检测STAT3总蛋白表达及磷酸化水平；分析STAT3表达及活化与pDC比例相关性；利用TargetScan预测与STAT33UTR具有潜在结合位点的miRNA，发现miRNA-6165与STAT33UTR具有潜在的结合位点；通过q-PCR法检测临床样本PBMC中miRNA-6165表达，分析其与STAT3表达的相关性；体外实验观察调控miRNA-6165表达对STAT3信号通路的影响；双荧光素酶报告基因系统检测miRNA-6165与STAT3mRNA3UTR的结合位点。
结果：
与正常妊娠组比较，URSA组PBMC中pDC比例降低(P＜0.05)、STAT3mRNA及蛋白表达和磷酸化水平均降低(P＜0.05)，且STAT3mRNA及蛋白磷酸化水平与pDC比例呈显著正相关(P＜0.05)。TargetScan7.1生物信息软件预测显示，miRNA-6165与STAT3mRNA3UTR之间存在潜在碱基互补结合位点。临床表达验证发现URSA患者PBMC中miRNA-6165表达显著升高(P＜0.05)，且与STAT3mRNA表达呈显著负相关(P＜0.05)。体外实验结果显示，在293T细胞中过表达miRNA-6165能显著降低STAT3mRNA、STAT3总蛋白及p-STAT3蛋白表达(P＜0.05)；下调miRNA-6165表达能明显升高STAT3mRNA、STAT3总蛋白及p-STAT3蛋白表达(P＜0.05)。双荧光素酶报告基因系统检测显示，上调miRNA-6165能显著抑制野生型STAT3mRNA3UTR荧光素酶报告基因活性(P＜0.05)，但对突变型STAT3mRNA3UTR荧光素酶报告基因活性无显著影响(P＞0.05)，证实miRNA-6165通过碱基互补配对直接结合STAT3mRNA3UTR，进而抑制STAT3mRNA表达，降低pDC亚群分化及功能，打破母胎免疫耐受状态，导致URSA。
结论：
1.STAT3信号通路调控的pDC亚群分化异常参与了URSA的发生。
2.miRNA-6165表达升高抑制STAT3信号通路，进而降低pDC亚群分化可能是URSA发生的重要原因。
3.靶向miRNA-6165/STAT3信号通路调节pDC亚群分化可能成为诱导母胎免疫耐受防治URSA的有效靶点与途径。
妊娠20周前自然流产连续发生2次或2次以上称为复发性流产(Recurrent spontaneous abortion, RSA)，根据世界卫生组织(WHO)的估计发病率约占临床公认妊娠的15%，不仅严重影响到全世界大约5%的育龄妇女生殖健康，同时也严重影响到育龄妇女心理健康。我国二胎政策的放开以及女性晚育率的升高致使RSA发病率大幅度上升。多年来研究人员试图确定RSA的发病机制，然而，除了已知的致病因素包括染色体异常、内分泌因素、解剖、感染和免疫功能障碍外，约50%RSA病例的病因仍未能解释，称为不明原因复发流产(Unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)。URSA不仅严重影响妇女生殖健康，也给患者和家庭带来巨大压力，其诊断与防治已成为生殖医学领域亟待解决的难题。胚胎携带父方组织相容性抗原，相对于母体犹如半同种异体移植，但正常情况下并未受到母体的免疫排斥，而是能够在母体内正常生长发育直至分娩，母胎免疫耐受在其中发挥着重要的作用。如果母胎免疫耐受状态失衡，将导致流产发生。
树突状细胞(Dendritic cell，DC)是体内唯一能够活化初始T细胞的抗原提呈细胞(Antigen presenting cell，APC)，能够识别、获取、加工抗原，并将MHC-抗原复合物提呈给T细胞(T lymphocyte，T cell)使其活化、增殖和分化，在抵抗病原微生物感染、维持机体内环境稳定中发挥着关键作用。DC可以分为经典DC(cDC)及浆细胞样DC(pDC)，cDC具有强大的抗原提呈功能，而pDC通过分泌IL-10、TGF-β等细胞因子诱导T细胞向Th2、Treg亚群分化，在诱导机体免疫耐受中发挥作用。研究证实人类蜕膜组织中存在DC，且与大量集簇的T细胞紧密相邻，并且发现DC在妊娠维持过程中具有重要作用。我们前期研究证实URSA患者及模型小鼠存在DC亚群偏移，pDC比例减少，但导致这一现象的原因尚不清楚，从而限制了调控DC诱导母胎免疫耐受治疗URSA方法与药物的发掘。
随着对DC发育分化研究的不断深入，发现酪氨酸激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)信号通路是调控DC发育分化的关键通路。其中，转录激活蛋白3(STAT3)是此信号通路关键分子，对pDC分化发育具有重要调控作用。但URSA患者中pDC下调是否与STAT3有关，及STAT3上游调控机制尚不明确，此方面的深入研究将进一步揭示URSA中pDC分化失衡的根源，为临床治疗提供新的靶点和途径。
随着人类基因组计划的完成及DNA元素百科全书计划的启动和推进，使得非编码RNA表观遗传调控生命活动及疾病发生发展的研究成为医学领域的新热点。目前对URSA的研究发现，染色体异常仅占3%～5%，我们不禁推测非编码RNA表观遗传机制可能在URSA母胎免疫耐受失衡中扮演了重要角色。微小核糖核酸(MicroRNA， miRNA)是一类长约20-24个核苷酸的非编码RNA，对靶基因起调控作用，参与机体大多数生命过程。现已发现miRNAs大量表达于人的血液、蜕膜、绒毛中，并且URSA患者miRNAs表达与正常妊娠妇女具有显著差异，miRNAs表达失调与RSA的发病机制密切相关，但尚未见miRNA调控pDC分化影响母胎免疫耐受机制的研究报道。此方向的深入研究有望从表观遗传免疫调控方向揭示URSA发病原因，为临床治疗URSA提供新方向。
目的：
探讨微小RNA-6165(miRNA-6165)调控STAT3信号通路干预pDC亚群分化与功能在URSA中的作用与关键机制,从表观遗传免疫调控方向揭示URSA发病原因，为临床治疗提供理论依据。
方法：
选取正常早孕妇女(正常妊娠组)和URSA患者(URSA组)各30例，空腹抽取静脉血，分离单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，流式细胞术检测pDC比例；q-PCR法检测STAT3mRNA表达水平；WesternBlot检测STAT3总蛋白表达及磷酸化水平；分析STAT3表达及活化与pDC比例相关性；利用TargetScan预测与STAT33UTR具有潜在结合位点的miRNA，发现miRNA-6165与STAT33UTR具有潜在的结合位点；通过q-PCR法检测临床样本PBMC中miRNA-6165表达，分析其与STAT3表达的相关性；体外实验观察调控miRNA-6165表达对STAT3信号通路的影响；双荧光素酶报告基因系统检测miRNA-6165与STAT3mRNA3UTR的结合位点。
结果：
与正常妊娠组比较，URSA组PBMC中pDC比例降低(P＜0.05)、STAT3mRNA及蛋白表达和磷酸化水平均降低(P＜0.05)，且STAT3mRNA及蛋白磷酸化水平与pDC比例呈显著正相关(P＜0.05)。TargetScan7.1生物信息软件预测显示，miRNA-6165与STAT3mRNA3UTR之间存在潜在碱基互补结合位点。临床表达验证发现URSA患者PBMC中miRNA-6165表达显著升高(P＜0.05)，且与STAT3mRNA表达呈显著负相关(P＜0.05)。体外实验结果显示，在293T细胞中过表达miRNA-6165能显著降低STAT3mRNA、STAT3总蛋白及p-STAT3蛋白表达(P＜0.05)；下调miRNA-6165表达能明显升高STAT3mRNA、STAT3总蛋白及p-STAT3蛋白表达(P＜0.05)。双荧光素酶报告基因系统检测显示，上调miRNA-6165能显著抑制野生型STAT3mRNA3UTR荧光素酶报告基因活性(P＜0.05)，但对突变型STAT3mRNA3UTR荧光素酶报告基因活性无显著影响(P＞0.05)，证实miRNA-6165通过碱基互补配对直接结合STAT3mRNA3UTR，进而抑制STAT3mRNA表达，降低pDC亚群分化及功能，打破母胎免疫耐受状态，导致URSA。
结论：
1.STAT3信号通路调控的pDC亚群分化异常参与了URSA的发生。
2.miRNA-6165表达升高抑制STAT3信号通路，进而降低pDC亚群分化可能是URSA发生的重要原因。
3.靶向miRNA-6165/STAT3信号通路调节pDC亚群分化可能成为诱导母胎免疫耐受防治URSA的有效靶点与途径。