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目的:1.临床部分EGFR-TKIs已成为EGFR敏感突变的ⅢB/Ⅳ期非小细胞肺癌的一线治疗。在临床实践中,通过观察发现ⅢB/Ⅳ期非小细胞肺癌中医寒证患者的EGFR突变率高于热证,故该研究主要探讨中医寒热证候与EGFR基因状态是否存在关联性,研究结果可为进一步选择何种治则(清热/温阳)中药联合EGFR-TKIs提供有力理论依据。2.实验部分选取2种对EGFR-TKIs不同敏感度的人肺腺癌细胞株(H1975、PC9)接种于裸鼠皮下,成功构建肺癌移植瘤模型,以期模拟临床中对EGFR-TKIs耐药与敏感患者。观察不同治则(清热/温阳)中药联合EGFR-TKIs后对两种肺癌移植瘤疗效的影响,明确何种治则中药联合EGFR-TKIs后具有协同作用,并揭示其可能存在的分子学机制。方法:1.临床部分该研究采用前瞻性观察性研究方法,纳入初治及复发(至少6个月内未接受抗肿瘤治疗)的ⅢB/Ⅳ期非小细胞肺癌患者,对其进行中医四诊资料采集与EGFR基因检测,且由至少2位中医师分别对患者进行中医寒热证候辨证,然后分析患者中医寒热证候与EGFR基因状态是否存在关联性;将四诊资料纳入聚类分析进行中医证候分类,验证中医证候分类结果与寒热证候、EGFR基因状态之间是否存在相关性;最后,将EGFR基因状态与其他因素采用非条件逐步多元logistic回归分析,再次明确EGFR基因状态与中医寒热证候是否存在独立相关性。2.实验部分EGFR-TKIs耐药模型是由人肺腺癌细胞株H1975构建的肺癌移植瘤:培养足量细胞,将其配置为浓度为3×107的细胞悬液,皮下注射于60只BALB/c裸鼠右前肢靠近背侧,每只注射0.2ml,成功建立模型后,将裸鼠采用区组随机方法分为6组,即生理盐水组、参附汤组、清开灵口服液组、参附汤联合吉非替尼组、清开灵口服液联合吉非替尼组,每组10只,相应药物干预21日,每隔2日进行瘤体长径及与其相垂直的最短径测量,并对裸鼠称重,检测移植瘤体积、裸鼠体重及瘤重,并绘制瘤体生长曲线,计算抑瘤率。并利用免疫组化法检测EGFR信号通路相关蛋白表达。EGFR-TKIs敏感模型是由人肺腺癌细胞株PC9构建的肺癌移植瘤:同上述造模方法;不同之处:皮下接种于BALB/c裸鼠的细胞浓度为2×107/ml;相应药物干预14日;每隔1日测量瘤体。结果:1.临床部分(1)从2013年3月到2015年5月共纳入310例患者,其中299例接受EGFR基因检测。对纳入的310例患者进行中医寒热辨证,寒证患者175例(56.45%),热证患者135例(43.55%),其中EGFR突变患者中寒证76例(45.24%),热证34例(25.95%);EGFR野生型患者中寒证患者92例(54.76%),热证患者97例(74.05%)。研究发现:患者EGFR基因状态与中医寒热证候存在关联性(P=-0.001)。(2)对四诊资料纳入聚类分析将所有患者分为A组与B组,其中A组132例(45.2%)与B组160例(54.8%),进一步对A、B两组患者中医寒热证候及EGFR基因状态分析,研究发现:A组中98例(74.24%)与B组中66例(41.25%)属于寒证,A组中34例(25.76%)与B组中94例(58.75%)属于热证,证明患者中医寒热证候与聚类分析证候分类结果存在关联性(P<0.001);其中A组中58例(45.67%)与B组中44例(28.57%)为EGFR突变型患者,A组中69例(54.33%)与B组中110例(71.43%)为EGFR野生型患者,再次证明患者EGFR基因状态与聚类分析证候分类结果之间同样存在关联性(P=-0.003)。(3)采用非条件逐步多元logistic回归分析,结果显示:患者EGFR基因状态、血压、吸烟史三者与中医寒热证型之间存在独立关联性。2.实验部分(1)H1975细胞株肺癌移植瘤不同治则中药联合吉非替尼对移植瘤体积的影响:清开灵口服液组与参附汤组相比,差异具有统计学意义(P<0.001);参附汤联合吉非替尼组与吉非替尼组相比,差异无统计学意义(P=0.311),但清开灵口服液联合吉非替尼组与吉非替尼组相比,差异具有统计学意义(P=-0.020),且清开灵口服液联合吉非替尼组与参附汤联合吉非替尼组相比,差异同样具有统计学意义(P=0.002)。不同治则中药联合吉非替尼对瘤重的影响:清开灵口服液组与参附汤组相比,差异具有统计学意义(P=-0.001);参附汤联合吉非替尼组与清开灵口服液联合吉非替尼组相比,差异亦具有统计学意义(P=-0.008),但两者与吉非替尼组相比,差异均无统计学意义(P>0.05);清开灵口服液联合吉非替尼后金正均q值为1.19,即说明两药联合后可能具有协同作用,且肿瘤抑制率最高为49.80%,作用机制可能是通过下调AKT、P-AKT、EGFR蛋白表达实现。而参附汤联合吉非替尼后金正均q值为0.50,即说明两药联合后可能表现为拮抗作用,其作用机制尚未被发现。(2)PC9细胞株肺腺癌移植瘤不同治则中药联合吉非替尼对移植瘤体积的影响:清开灵口服液组与参附汤组相比,差异具有统计学意义(P<0.001);参附汤联合吉非替尼组、清开灵口服液联合吉非替尼组与吉非替尼组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。不同治则中药联合吉非替尼对瘤重的影响:清开灵口服液组与参附汤组相比,差异无统计学意义(胗0.05);参附汤联合吉非替尼组、清开灵口服液联合吉非替尼组与吉非替尼组相比,差异同样无统计学意义(P>0.05)。结论:1.ⅢB/Ⅳ期非小细胞肺癌患者中医寒热证候与EGFR基因状态可能存在关联性,即EGFR基因突变型患者以中医寒证多见,EGFR基因野生型患者以中医热证多见。2.对于EGFR-TKIs耐药型人肺腺癌细胞株H1975的移植瘤,清热类的清开灵口服液在吉非替尼耐药时可能更适合与吉非替尼联合应用,且联合后可能具有协同增敏作用,其机制可能与下调AKT、P-AKT、 EGFR蛋白表达有关。参附汤联合吉非替尼后可能具有拮抗作用,其机制尚未被发现。该研究结论可能为患者在EGFR-TKIs耐药时选择何种治则中药提供有力理论依据。3.对于EGFR-TKIs敏感型人肺腺癌细胞株PC9的移植瘤,由于该移植瘤对吉非替尼反应极其敏感,无法证实温阳类或清热类中药联合吉非替尼后是否具有协同或拮抗作用。