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背景:现代社会由于过度食用高脂食物造成肥胖人群越来越多。过量的膳食脂肪会增加脂肪和非脂肪组织的脂质含量,并通过脂肪毒性引起组织慢性炎症,导致细胞功能障碍和死亡。线粒体功能异常和过量的氧化应激可能是肥胖等因素导致迟发性性腺功能低下的主要发病机制。由于睾酮合成限速步骤在线粒体完成,且睾丸间质细胞具有较高的基础自噬活性,研究表明白藜芦醇(RSV)对代谢性疾病的治疗效应与其调节自噬作用有关,但自噬机制在高脂饮食(HFD)导致肥胖小鼠睾酮合成减退及RSV保护效应中的作用亟待研究。目的:研究高脂饮食引起的肥胖相关代谢性疾病对睾酮合成的不利影响,以及白藜芦醇对男性生殖系统保护效应中的自噬机制及作用,并从体外调节TM3细胞的自噬水平及诱导氧化应激,进一步研究自噬介导的白藜芦醇减轻线粒体功能异常和氧化应激、保护睾酮合成通路的机制,从而阐明自噬在白藜芦醇保护高脂饮食小鼠睾丸Leydig细胞功能中的作用。方法:60只8周龄的雄性C57BL/6J雄鼠,随机分为四组:分别给以高脂饮食(HFD group)或高脂饮食添加白藜芦醇的(HFD+RSV group,400 mg/kg/day)灌胃,对照组用基础饲粮不添加RSV(Ctrl group)或添加等量RSV(Ctrl+RSV group)。所有饮食均维持20周后结束造模,测量体重、血脂、激素及组织取材。苏木精伊红染色(HE染色法)和3β-HSD的免疫组织化学染色(IHC)观察小鼠睾丸及间质细胞的形态学变化;Western blot法检测睾酮合成、氧化应激(oxidative stress,OS)、自噬及线粒体功能相关指标的表达。另将TM3细胞分别用HCG、RSV、RAPA或3-MA处理后进行培养,以H2O2诱导OS,用CCK8法检测细胞活率、流式细胞术检测线粒体膜电位(MMP)、倒置荧光显微镜观察细胞自噬小体数量,收集细胞后用Western blot法检测睾酮合成、氧化应激、自噬以及线粒体功能相关蛋白表达的变化。结果:1.RSV对高脂饮食小鼠睾酮合成的保护作用:添加RSV可显著减轻HFD导致的小鼠体重增加和睾酮水平降低,睾丸组织St AR、3β-HSD蛋白检测和体外分离Leydig细胞刺激睾酮合成实验表明,RSV改善HFD导致的睾酮合成能力减退。2.RSV减轻高脂饮食小鼠睾丸组织的OS和线粒体功能障碍:RSV抑制HFD导致的线粒体功能相关蛋白mt TFA、COX-4和氧化应激相关蛋白/酶SOD2和GPX4表达水平的下调和抗氧化能力降低,3.RSV抑制高脂饮食小鼠睾丸组织自噬:通过自噬小体观察及LC 3II/I、Beclin 1、ATG7表达变化表明RSV抑制HFD导致的睾丸组织自噬失调。TM3细胞系给予自噬激动剂(rapamycin,RAPA)和抑制剂(3-MA)进行处理,结果表明自噬活性与TM3细胞St AR表达水平密切正相关。4.自噬在保护TM3细胞免受RSV氧化损伤中的作用:用H2O2处理TM3细胞诱导氧化应激,RAPA或3-MA预处理以研究自噬水平改变对RSV抗氧化保护作用的影响。与单独使用RSV组相比,3-MA+RSV组的LC3Ⅱ/Ⅰ和St AR蛋白表达显著下调,线粒体功能失调,3-MA抑制自噬而削弱了RSV保护作用;RAPA+RSV组睾酮合成也显著减少、细胞活性降低。结论:自噬机制在RSV对高脂饮食小鼠Leydig cell睾酮合成保护功能中起关键作用,调节自噬水平影响RSV对线粒体功能失调和氧化应激的减轻,自噬在RSV防治肥胖相关代谢性疾病引起的性腺功能低下治疗作用中具有潜在价值。