论文部分内容阅读
研究背景及目的急性心肌梗死是一种由于长期缺血导致心肌细胞死亡的疾病,它是冠脉疾病最严重的表现。心肌梗死的修复与血管状况密切相关,血管的快速生成对于建立良好的侧支循环,改善梗死区的血液供应,最终影响心梗后的生存和预后,具有非常重要的意义。将血管再生基因转移至局部缺血心肌有望成为治疗缺血性心脏病（Ischemic heart disease,IHD）的有效方法,与经皮冠脉介入和冠状动脉搭桥手术等临床应用相比,高效基因传递系统与心肌特异性启动子的组合应用可能提供足够的生物安全性。已经表明,血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）是血管生成过程中的关键调节因子,VEGF165能够以剂量依赖方式增强心室肌细胞L型钙电流。腺相关病毒（Adeno-associated virus,AAV）载体可以将VEGF基因有效地递送到缺血性小鼠心肌中。然而,在心肌内注射后,可在心外器官发现AAV基因组,并且开胸注射的二次伤害对体质虚弱的IHD患者来说是沉重的打击。为确保以最小侵入手段准确地向心肌内递送目的基因,我们使用了心肌特异性肌钙蛋白T（cTNT）启动子和促进基因表达的内含子和转录后调控因子WPRE来调控心脏特异性的hVEGF165表达。构建了rAAV-cTNT-VEGF 165-Flag-EGFP-WPRE载体系统,通过尾静脉注射载体感染心梗小鼠心脏。左西孟旦,钙离子增敏剂,是一种新颖的正性肌力药,一方面通过直接与肌钙蛋白C结合改变心肌纤维的钙结合信息的传递使心肌收缩力增加,而不影响心率和心室舒张功能。另一方面通过激活平滑肌细胞膜ATP敏感的钾通道使血管扩张,降低心脏前后负荷和冠脉循环阻力,对治疗心衰有利。当大剂量使用时,具有一定的磷酸二酯酶抑制作用,起到额外的正性肌力作用。本研究建立在小鼠急性心肌梗死模型的基础上,分别采用rAAV-cTNT-VEGF165载体基因治疗和左西孟旦间断重复给药抗心衰治疗,初步探讨两种治疗方法对心肌梗死小鼠的心肌保护作用及其机制,对比两种方法治疗效果的差异性和优越性;探讨尾静脉递送rAAV介导的人源VEGF165基因的可行性,为以VEGF165为基础的基因治疗心肌梗死提供临床应用基础。研究方法采用冠状动脉左前降支结扎术制作小鼠急性心肌梗死模型,随机分为假手术组（sham,n=15）,生理盐水组（NS,100μl,n=25）,AAV-EGFP 处理组（EGFP,5×1011V.G./100μl,n=25）,AAV-VEGF165 治疗组（VEGF,5×1011V.G./100μl,n=25）和左西孟旦治疗组（levo.,1365μg/kg·1w,n=25）。1.分别于术前、术后2W、术后4W采用心脏超声法检测小鼠心功能,计算左室射血分数（LVEF%）、左室短轴缩短率（LVFS%）、左室收缩末内径（LVIDs）、左室舒张末内径（LVIDd）、收缩末左室后壁厚度（LVPWs）、舒张末左室后壁厚度（LVPWd）、舒张末左室前壁厚度（LVAWd）、收缩末左室前壁厚度（LVAWs）。2.通过心肌组织冰冻切片共聚焦显微镜观察用绿色荧光蛋白（EGFP）标记的hVEGFA的表达水平及表达部位;免疫组织化学染色法检测VEGFA,CD31,PCNA表达水平及表达部位,TUNEL法检测心肌组织细胞凋亡水平。3.应用实时荧光定量PCR技术（RT-qPCR）测定小鼠心肌组织VEGF165,VEGFR2,Collagen Ⅲ mRNA含量和蛋白质印迹术（Western blot,WB）检测心肌组织VEGFA,Bax,Bcl-2蛋白的相对表达。4.组织学评估HE染色法检测梗死周边区心肌细胞大小形态等病理变化,Masson染色观察心肌间质胶原沉积和计算心肌梗死面积。通过测量心重/体重（HW/BW）、肺重/体重（LW/BW）和心重/胫骨长度（HW/TL）评估心肌重塑情况。结果1.心肌梗死后尾静脉注射rAAV载体可在体内稳定转导,WB显示人源VEGF165基因可在心肌组织中特异性表达,qPCR显示VEGF165和VEGFR2mRNA转录水平显著提高。2.尾静脉注射AAV9-VEGF165治疗优于左西孟旦药物治疗,可更加客观显著改善心肌梗死小鼠心功能和生存率。3.小鼠行冠状动脉结扎4W后,心梗组与sham组相比,左室收缩功能各项指标分别下降;与EGFP组相比,VEGF组左室收缩功能显著提高,levo.组差异无统计学意义;与levo.组相比,VEGF组收缩功能改善明显。4.组织学评估显示,VEGF组和levo.组左室病理重塑在心梗后减弱,梗死面积均显著减小,心肌重塑指标显著降低,levo.组无统计学意义。5.免疫组织化学显示VEGF组毛细血管密度和细胞增殖增加,TUNEL阳性心肌细胞数量减少,左西孟旦组无统计学意义。结论我们首次证明,心梗后单次静脉注射pAAV-cTNT-VEGF165-Flag-EGFP-WPRE载体可在心脏中提供稳健的早期VEGF165表达,证明cTNT启动子足以在单次全身注射后实现治疗性VEGF165转录,并通过促进血管生成和保护心肌细胞免受缺血诱导的细胞凋亡而部分恢复左室收缩运动和功能,减少纤维化和梗死面积限制不良重塑,且效果优于左西孟旦药物治疗。