近年来,毛细管电泳技术由于分离效率高、分析速度快、试剂消耗量少及可与多种检测器连用等独特优势,在酶反应动力学研究中受到越来越多关注,已逐渐发展为在线酶分析的有力平台,在酶活性测定、抑制剂高通量筛选、以及利用酶反应检测痕量或复杂样品等方面发挥着重要作用。目前基于毛细管电泳技术的在线酶分析方法主要涉及三种模式:电泳媒介微分析、毛细管微酶反应器和酶反应过程在线连续监测。毛细管微酶反应器是以毛细管为酶固定化载体的一种酶反应装置,该装置不仅是酶反应发生的场所,也是底物和产物的分离通道。酶反应过程在线连续监测,尤其是对酶反应全程的高时间分辨监测,使我们可以准确获得反应机制和反应动力学常数,有助于我们深入了解酶反应的机制,监测酶活性随反应历程的变化,从而更好地认识酶在生物代谢中的功能,在酶抑制类药物的研发以及疾病的临床诊断中具有重要意义。本论文基于毛细管电泳技术,针对以上两种在线酶分析体系的构建和应用展开研究,内容包括以下四个部分:(1)填充式毛细管电泳-固定化酶微反应器的设计与制备。该反应器采用直径110-μm,孔径2-μm通透的单颗粒二氧化硅球作为柱塞,直径20-μm并带有1-μm孔的商品化固载胰蛋白酶的二氧化硅球作为填料,具有制备简单快速,酶的填充长度和填充量容易调节等优点。我们系统研究了制备的填充式酶反应器对于在线酶反应分析可靠性,此外还考察了酶的填充长度对迁移时间和酶活性的影响。测得的固定化酶的活性常数和最大反应速度(Km:1.23±0.04 m M,Vmax:2.99±0.10 m M/s)与实验测得的线外酶反应数据相符,表明此方法没有引起酶结构上的改变和酶活性的降低。连续运行100次底物和产物峰面积的RSD%分别为4.0%和4.1%,其迁移时间RSD%分别为3.7%和3.8%;经过连续10天50次的测定,其活性仍可保持最初活性的90%,以上结果均表明该填充式毛细管-固定化酶微反应器具有很好的重现性和稳定性。(2)利用制备的填充式毛细管微酶反应器,研究胰蛋白酶抑制动力学以及对蛋白质样品的在线水解分析。在最优条件下,测得抑制剂苯甲醚盐酸盐的抑制动力学常数Ki为3.2±0.2 m M,半数抑制浓度IC50为5.0±0.3 m M,与线外测定的结果吻合,证实了该方法研究酶抑制动力学的准确性。该酶反应器成功应用于肌红蛋白和牛血清蛋白样品的快速在线水解分析。质谱表征结果显示,线上(无温育)水解肌红蛋白和牛血清蛋白的肽段序列覆盖率分别为77%和35%,与传统线外水解反应(温育时间长达12小时)结果一致,表明该方法在蛋白质分析中具有很好的应用前景。(3)毛细管电泳二维连续扩散进样的理论和实验研究。利用穿过样品池且相距5-μm的两根同轴毛细管,成功构建了毛细管电泳连续分析装置。该装置设计简单,操作方便,通过狭缝处样品自由扩散(无需依靠衍生或其他化学反应)以及分离电压周期性的开关,实现了准确的在线连续进样和连续毛细管电泳分离分析。建立了基于毛细管电泳二维连续扩散进样体系的理论模型。在菲克第二定律的基础上,推导出进样量与样品初始浓度,进样时间和狭缝宽度间的关系式。采用标准物质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)作为分析物,针对所建立的理论模型进行了系统的实验验证,实验结果与理论预测完全吻合。实验结论表明该体系为二维连续扩散进样体系,同时具有横向和纵向双向扩散,与传统的界面浓度扩散相比大大增加了扩散效率。20次连续进样,NADH峰面积和峰宽的RSD%分别为2.08%和1.83%,亦显示出该体系具有很好的重现性和稳定性。(4)毛细管电泳二维连续扩散进样体系在酶分析和复杂样品连续分析中的应用。利用毛细管电泳二维连续扩散进样体系,在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的全程反应中,每隔40s检测产物NADH的生成,实现了葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化反应全程在线监测。测得葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的米氏常数Km与线外测定结果相吻合,表明该方法在酶分析测定方面的准确性。在酶反应抑制动力学研究中,成功获得了谷丙转氨酶抑制动力学参数,显示了该体系在抑制反应研究以及抑制剂筛选领域的应用前景。此外,我们还将该体系成功地应用于氨基酸混合样品的毛细管电泳连续分析,实现了四种氨基酸连续进样及分离分析。该方法具有很好的重现性,连续九次序列进样氨基酸的分离度和理论塔板数的RSD%分别小于3.45%和3.96%。以上结果表明,基于毛细管电泳技术的二维连续扩散进样体系是有效精确的连续分析的有力工具,不仅可用于在线监测各种生物进程,而且能够连续分析复杂样品。