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胰腺癌是一种恶性程度很高,进展迅速,预后极差的恶性肿瘤,近年来其患病率在全球范围内呈上升趋势。手术是治疗胰腺癌的主要手段,但由于其解剖位置隐蔽,临床症状不典型,患者就诊时多已是中晚期,甚至已经伴远处转移,因此手术的根治切除率很低;且由于胰腺癌对细胞毒性药物的耐受,放化疗效果也很不理想。因此,寻求新型有效的治疗方法势在必行。在肿瘤免疫过程中,T细胞的免疫功能起着关键作用。在多数肿瘤中,包括胰腺癌中,肿瘤细胞可通过减少MHC I的表达及MHC II的递呈,降低共刺激信号的表达,使肿瘤抗原无法有效地提呈给T细胞,宿主免疫系统对肿瘤细胞的反应性降低,无法识别肿瘤细胞,进而产生免疫逃逸。因此,在导致T细胞激活的多个途径或环节中进行促进,是目前肿瘤免疫治疗研究的热点之一。主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex, MHC)II类分子主要表达于活化的T细胞、B细胞、巨噬细胞以及APC表面,是T、B细胞活化的必要信号。其主要作用是以抗原肽MHCⅡ类分子复合物的形式将外源性抗原提呈给Th细胞,导致Th细胞的激活和分化,因而在诱发和调节获得性免疫应答中起重要作用。Satoh A等证实,高水平的MHC II类分子表达常与较好的肿瘤预后密切相关。MHC II类分子的表达主要在转录水平。MHC II类分子反式激活因子基因(MHC class II transactivator, CIITA)首次发现是在1993年。CIITA是MHC II类基因表达的“分子开关”,对MHC II类基因的组成性型和诱导型表达起关键作用,决定着MHC II类分子表达的有无和高低,是MHC II类分子相关疾病较好的干预靶点。因此,CIITA的发现使我们利用CIITA对MHCII类分子的表达进行调节,进而对正常细胞和病理细胞进行改造成为一种可能。通过外源性刺激提高CIITA基因的表达,增强MHCII类分子的表达,进而促进肿瘤细胞抗原的提呈,可达到阻断肿瘤细胞免疫逃逸,治疗肿瘤的目的。本课题拟制备携带CIITA基因的重组腺病毒载体,并在体外证实转染CIITA基因后促进MHC II类分子表达的情况。本研究的预期结果有望为胰腺癌的肿瘤免疫治疗提供新的途径和启示。一、携带CIITA基因的重组腺病毒载体的制备目的:构建含有主要组织相容性复合物(MHC)II类分子激活物(CIITA)基因的重组腺病毒载体。方法:回收CIITA基因的纯化PCR产物插入pUC57质粒中,EcoRI和XhoI双酶切,U-Gene凝胶回收纯化目的基因片段(3300bp)。EcoRI和SalI双酶切质粒载体pShuttle-GFP-CMV,T4DNA酶连接上述目的基因片段和pShuttle-GFP-CMV片段,得到穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV-CIITA,经Kpn I单酶切,并送上海Sangon公司测序鉴定阳性克隆。用I-Ceu I/I-Sce I双酶切处理,回收纯化的目的基因片段,将腺病毒pAdxsi载体片段和插入目的片段进行T4DNA酶连接,得到腺病毒质粒pAdxsi-GFP–CIITA,XhoI酶切鉴定阳性克隆后,转染HEK293细胞并培养出重组腺病毒。扩增、纯化重组腺病毒Ad5-CIITA-GFP,测定病毒滴度。结果:重组穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV-CIITA经过Kpn I单酶切及测序分析,证实与GeneBank中公布的小鼠CIITA(NM-007575)序列完全相符。重组腺病毒pAdxsi- GFP–CIITA载体构建成功后在HEK293细胞中包装产生的重组腺病毒AdCIITA对HEK293细胞有致病作用。经多次重复感染并纯化后,病毒感染性滴度达2.0×1011PFU/ml。结论:成功构建了携带小鼠CIITA基因的重组腺病毒载体Ad5-CIITA-GFP。二、MHC II类分子表达促进试验目的:通过体外转染证实Ad-CIITA对组成型和诱导型表达的MHC II类分子的促进作用。方法:通过梯度感染的方法确定所需的病毒用量,以相对细胞数1:1,10:1,100:1的病毒颗粒分别转染小鼠巨噬细胞P388D1和预先用IFN-γ(500U/ml)刺激48小时的Hela细胞,荧光显微镜下观察转染效率。重组腺病毒Ad-CIITA及空白对照分别转染小鼠巨噬细胞P388D1和预先用IFN-γ(500U/ml)刺激48小时的人宫颈癌细胞Hela,收集正常细胞和转染后24、48、72小时的细胞,实时定量PCR检测CIITA基因的表达,FACS分析检测MHC II类分子的表达。结果:通过梯度感染显示较好的病毒转染效率为100:1。实时定量PCR显示转染后的细胞株较空白对照,CIITA基因的表达明显增强(P<0.05)。FACS分析显示组成型表达的小鼠巨噬细胞P388D1,重组腺病毒转染后较空白对照,MHC II类分子表达无明显促进(P>0.05);经IFN-γ(500U/ml)刺激48小时的诱导型表达的Hela细胞,重组腺病毒转染后较空白对照,可见MHC II类分子表达增强(P<0.05)。结论:组成型表达的肿瘤细胞转染Ad-CIITA后,MHC II类分子表达无明显促进作用,诱导型表达的肿瘤细胞可见MHC II类分子的表达增强。三、转染Ad-CIITA诱导不同种类(人和小鼠)胰腺癌细胞MHC II类分子表达试验目的:通过体外转染证实Ad-CIITA对不同种类(人和小鼠)胰腺癌细胞诱导性表达MHC II类分子的作用。方法:通过梯度感染的方法确定所需的病毒用量,以相对细胞数1:1,10:1,100:1的病毒颗粒分别转染预先用IFN-γ(500U/ml)刺激48小时的PanC-02细胞和CaPanC-2细胞,荧光显微镜下观察转染效率。腺病毒Ad-CIITA及空白对照分别转染IFN-γ刺激的PanC-02细胞和CaPanC-2细胞,收集正常细胞和转染后24、48、72小时的细胞进行FACS分析,检测胰腺肿瘤细胞MHCII类分子表达;RT-PCR和免疫印迹法检测胰腺肿瘤细胞CIITA基因表达。结果:通过梯度感染显示较好的病毒转染效率为100:1。FACS分析显示为诱导性表达的PanC-02细胞和CaPanC-2细胞,经IFN-γ(500U/ml)刺激48小时再用携带CIITA基因的重组腺病毒转染后,MHC II类分子表达较空白对照明显增强(P<0.05),转染后72小时表达增强最明显。RT-PCR鉴定:PanC-02细胞和CaPanC-2细胞转染后较空白对照,CIITA基因表达明显提高(P<0.05),且在转染后72小时表达最明显。免疫印迹法亦从蛋白水平上证明转染后的细胞株能表达CIITA基因。结论:Ad-CIITA转染人胰腺癌CaPanC-2细胞和小鼠胰腺癌PanC-02细胞后均可促进CIITA基因表达,进而可能增强MHC II类分子表达。通过上述研究,本课题得出以下结论:1、成功制备了携带CIITA基因的重组腺病毒载体Ad5-CIITA-GFP。2、Ad-CIITA转染两种肿瘤分子均能促进CIITA基因表达,但组成型表达的肿瘤细胞的MHCII类分子表达无明显促进,诱导型表达的肿瘤细胞能增强MHCII类分子的表达。3、Ad-CIITA对诱导型表达MHC II类分子的人胰腺癌CaPanC-2细胞和小鼠胰腺癌PanC-02细胞均可明显促进CIITA基因表达,进而可能增强MHC II类分子表达。小结:本研究通过成功制备携带CIITA基因的重组腺病毒,体外转染小鼠巨噬细胞P388D1以及IFN-γ(500U/ml)刺激48小时的Hela细胞、PanC-02细胞和CaPanC-2细胞,初步证实了携带CIITA基因的重组腺病毒转染进肿瘤细胞后能够成功表达CIITA基因,进而增强肿瘤细胞MHC II类分子的表达。据此可为胰腺癌的肿瘤免疫治疗提供新的途径和启示。