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阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种中枢神经系统进行性疾病,是失智症的一种,具有不可逆转性。其临床症状是认知功能障碍、记忆减退,日常生活能力逐步下降,同时伴有各种神经性精神症状和异常行为;病理特征表现为脑内有老年斑生成,神经发生纤维缠结。目前认为β淀粉样蛋白(βamyloid protein,Aβ)是AD致病的核心因子,对Aβ在AD中的致病作用研究主要集中在神经元变性死亡、炎症反应及氧化应激三个方面。Aβ是神经炎斑块的主要成分,最近的研究认为可溶性寡聚体Aβ在AD病程中可促进神经功能发生障碍和神经元的损伤死亡。小胶质细胞(Microglia,MG)是中枢神经系统中最具代表性的免疫反应细胞,在炎症发生时起重要作用。有研究表明当Aβ聚集形成斑块时,MG被迅速激活,MG膜受体表达迅速增大,清除吞噬Aβ的功能也呈增强的趋势,但当Aβ浓度足够大时,MG的清除功能可能会下降,Aβ浓度与MG清除吞噬能力变化之间的关系及机制还不清楚,推测该过程可能和MG上具有吞噬功能的清道夫受体A(Scavenger receptor A,SRA)蛋白表达有关;有研究发现通过Toll样受体2(Toll like receptor2,TLR2)抗体封闭技术可有效阻止AD脑内核转录因子(Nuclear transcription factor,NF-κB)的表达水平和肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白细胞介素1β(Interleukin 1β,IL-1β)等炎症细胞因子的产生,提示Aβ导致神经炎症的病理过程中TLR2可能作为激活NF-κB信号的上游因子,促进神经炎症的产生。但也有研究发现TLR2的缺失并没有引起促炎因子的释放减少。有研究发现AD患者脑中小胶质细胞上的晚期糖基化终产物受体((Receptor for advanced glycation end products,RAGE)表达上调,但其参与AD的机制尚不明确。小鼠小胶质细胞瘤(Rat microglia tumor cells,也叫BV2)目前在研究性实验尤其在细胞水平的实验里已被广泛用来代替MG进行AD相关领域的研究。本课题在细胞水平上采用BV2与不同浓度Aβ共孵育,观察小胶质细胞的形态变化及BV2上SRA、TLR2、RAGE相关蛋白的表达及炎症因子TNF-α、IL-1β的释放,深入分析Aβ浓度变化与BV2形态、功能变化的关系以及上述相关蛋白在其中的作用,为阐述小胶质细胞在AD发病中的作用、临床靶向用药治疗AD提供可靠的理论基础。目的:探讨BV2对Aβ的清除能力的变化与不同浓度Aβ之间的关系。BV2上SRA、TLR2、RAGE、核NF-κB蛋白表达水平及炎症因子TNF-α、IL-1β释放,分析不同浓度Aβ与BV2形态、功能变化之间的关系,上述相关蛋白在其中的作用,为阐述BV2在AD发病中的作用、临床靶向用药治疗AD提供可靠的理论基础。方法:正常培养的小胶质细胞与不同浓度Aβ(0,1,5,10,15μmol/L)共孵育48小时,镜下观察各组细胞形态变化,MTT法检测各组细胞活性,酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assays,ELISA)检测各组细胞培养上清中IL-1β、TNF-α的表达水平,细胞培养上清液中药物Aβ剩余量,免疫细胞化学法(Immunocytochemistry,ICC)及免疫印迹法(Western Blotting,WB)检测BV2上SRA、TLR2、RAGE、核NF-κB蛋白表达水平。结果:1细胞形态:BV2与不同浓度Aβ共孵育48小时后,0μmol/L组BV2胞体小,呈长形或三角形,含小而致密的核,具有细长高度分支的毛刺样突起;Aβ组BV2突起变短,伸出伪足,呈阿米巴样,随Aβ浓度增大逐渐呈现巨噬细胞形态。2细胞存活率:MTT结果显示1,5μmol/L组小胶质细胞存活率分别为(97.89±1.98)﹪,(82.89±1.73)﹪,10,15μmol/L组小胶质细胞存活率分别是(47.26±2.91)﹪,(43.75±0.21)﹪,较5μmol/L组显著降低(P<0.05)差异有统计学意义。3细胞培养上清液中IL-1β、TNF-α表达量及Aβ清除量:ELISA结果显示10、15μmol/L组IL-1β表达水平依次为(54.8333±2.9145)pg/m L,(59.2778±1.4510)pg/m L较5μmol/L组(13.5000±1.3298)pg/m L显著升高(P<0.05);10、15μmol/L组TNF-α表达水平依次为(72.0739±6.1020)pg/m L,(84.7128±7.2849)pg/m L,较5μmol/L组(66.1067±4.6830)pg/m L显著升高(P<0.05)。5μmol/L组Aβ被清除量(0.8693±0.0096)μmol/L明显高于1μmol/L组(0.7190±0.0045)μmol/L(P<0.05),10、15μmol/L组小胶质细胞Aβ被清除量依次为(0.4781±0.005)μmol/L,(0.2238±0.0021)μmol/L,较5μmol/L组显著降低(P<0.05),差异均有统计学意义。4免疫组化结果:ICC数据显示10、15μmol/L组SRA阳性反应面积依次为0.41±0.17,0.30±0.30,较5μmol/L组(0.84±0.22)显著降低(P<0.05),10、15μmol/L组TLR2(0.39±0.02,0.42±0.01)、RAGE(0.41±0.10,0.50±0.04)、核蛋白NF-κB(0.30±0.01,0.39±0.04)阳性反应面积较每个指标对应的5μmol/L组蛋白表达水平(TLR2 0.18±0.06,RAGE 0.29±0.08,NF-κB 0.19±0.07)显著增加(P<0.05);差异均有统计学意义。5免疫印迹结果:WB数据显示10、15μmol/L组SRA蛋白表达水平(1.13±0.49,1.08±0.30)较5μmol/L组(2.14±0.12)显著降低(P<0.05),10、15μmol/L组TLR2(0.88±0.14,0.91±0.31)、RAGE(0.54±0.17,0.59±0.21)及核蛋白NF-κB(1.63±0.01,1.84±0.36)表达水平较每个指标对应的的5μmol/L组蛋白表达水平(TLR2 0.45±0.15,RAGE 0.26±0.18,NF-κB 1.04±0.05)显著增加(P<0.05),差异均有统计学意义。结论:综上所述,Aβ与BV2共孵育,随着Aβ浓度升高(1,5μmol/L),BV2对Aβ的清除能力也逐渐升高,Aβ达到10μmol/L时,BV2清除Aβ能力降低。其机制可能与高浓度Aβ可引起小胶质细胞上SRA蛋白下调、TLR2蛋白上调、RAGE蛋白上调、NF-κB信号通路被激活、炎性因子IL-1β、TNF-α水平升高有关。