近些年来,随着结核杆菌病的死灰复燃以及超级细菌的出现,时刻提醒着人们细菌性传染病仍然是人类生命健康的重大威胁。传染病的早期诊断是开展治疗和防控的前提,是预防控制传染病的首要任务。随着科学技术的不断发展,人们发明了各种检测和诊断疫病的方法,如传统的微生物培养法、免疫检测法、分子生物学检测方法等。分子生物学检测方法是现代检测致病微生物的检测核心技术,尤以PCR技术为代表,其具有快速、灵敏、特异性强、且具有多种广泛的应用形式等优点。然而众多PCR衍生技术均是以基因组为检测靶标的方法,这些方法在检测病毒性致病微生物上很灵敏,但在检测细菌性致病微生物时却受到了一定的限制。因细菌基因组拷贝数等于细菌的数量,临床上一些细菌在宿主内的数量有限,尤其是胞内寄生菌,从而限制了分子生物学的检测。因此,提高这类病原的检测具有重要意义。编码基因在表达的时候,会转录出不同丰度的RNA,对于高表达的基因,其转录的m RNA丰度远高于编码基因本身。因此我们假设,如果将高表达的基因以及它转录出的m RNA作为检测的靶标,就有可能大大提高细菌检测的灵敏性。而根据逆转录PCR的原理,它有可能满足同时对DNA和RNA进行扩增的要求。且逆转录PCR已经在病毒性微生物的检测中以及活菌的检测中得到普遍应用,但在细菌性致病微生物的检测中尚未见到报道。本实验以马耳他布鲁氏菌16M为模型菌,提取16M的RNA进行转录组测序寻找高表达基因,并将此基因与它转录生成的m RNA作为检测靶标,利用实时荧光定量逆转录PCR的方法,实现对细菌性致病微生物快速灵敏的检测。为了比较基于转录本检测的实时荧光定量逆转录PCR方法的可行性,我们比较了RT-q PCR和q PCR对DNA和RNA的扩增效率,结果发现:RT-q PCR方法既可以对DNA进行有效扩增又可以对RNA进行有效扩增,而q PCR方法只能对DNA进行有效扩增。然而,在比较RT-q PCR对DNA和RNA的扩增效率时,我们发现RT-q PCR对RNA扩增的CT值远远大于对DNA扩增的CT值,这与理论不符。为此我们比较了RNA的浓度用DNA酶处理前后的变化。结果发现用Trziol裂解法所提取的RNA中存在着严重的DNA的污染,且该方法所提取的RNA效率低,只有22.7%是RNA分子,不足以用于RT-q PCR方法的检验。为了提高RT-q PCR的检测效率,我们用一种简单的热变性方法处理样本,得到总核酸,再分别进行RT-q PCR和q PCR实验,结果发现,RT-q PCR实验检测总核酸的CT值比q PCR检测总核酸的CT值小5个数值,说明该种方法可以避免RNA损失,提高了RT-q PCR方法的检测效率。为了进一步比较应用热变性处理样品后RT-q PCR方法和q PCR方法检测的灵敏性,我们将16M总核酸进行10倍梯度稀释,结果表明,对于每一个梯度稀释的总核酸,RT-q PCR方法检测的CT值都要比q RCR方法检测的CT值小5个数值,且RT-q PCR方法的检测下限低于q PCR方法的检测下限。为了找到合适的靶基因对16M进行检测,我们对其他的候选基因进行比较分析,结果表明,基因BMEI1305的检测效果最佳,可作为应用RT-q PCR方法检测马耳他布鲁氏杆菌16M的靶标。为了评价RT-q PCR检测方法在临床样本上的敏感性,我们对10名血清学检测为阳性的布病患者的血液进行了比较评价,发现在这10份样品中,应用q PCR方法检测出4份样品为阳性;应用RT-q PCR方法检测出6份样品为阳性。这些数据表明,在布病的诊断中,RT-q PCR的检测灵敏性和准确性高于q PCR的检测方法,可以减少假阴性率的发生。为了评价该方法是否具有通用性,我们在五种致病性细菌上较了q PCR和RT-q PCR的检测效率。结果发现,在这五种细菌中RT-q PCR的检测方法比q PCR的检测方法都灵敏。表明RT-q PCR可以作为一种通用的检测方法。综上,以转录本为基础的RT-q PCR检测方法在对细菌性致病微生物的检测上具有灵敏性高,特异性好,且具有通用性等特点,可以为作为辅助临床诊断的检测方法。