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背景与目的动脉粥样硬化（AS）是一类由脂质沉积引起的复杂炎症性动脉疾病,是心脑血管疾病的重要发病基础。中医理论中“阴虚瘀热蕴毒”是AS的关键病机,因此本实验所用的养阴清热方将有滋阴、清热和活血功效的中药配伍,已在临床AS的治疗上取得了显著疗效。在AS中,T细胞的活化水平,以及调节性T细胞（Treg）与辅助性T细胞（Th）17的比例对疾病的进展起着重要作用。树突状细胞（DC）作为连接先天性及获得性免疫的桥梁,介导T细胞的活化及分化,从炎症反应的源头控制着AS的发生和发展,而DC胞内的胆固醇含量影响着它的炎性功能。此外,感染引起的慢性炎症也能加重高脂血症诱发的AS。前期研究发现养阴清热方通过调节Treg/Th17平衡改善高脂饮食载脂蛋白E敲除（ApoE-/-）小鼠的AS,但对感染环境下的作用未知。因此,本实验通过细菌来源的抗原热休克蛋白（HSP）65考察养阴清热方对感染背景下高脂饮食ApoE-/-小鼠AS的效应,研究是否与对DC胆固醇代谢的调控相关,并筛选出影响DC胆固醇代谢,进而干预炎症的活性成分。研究方法ApoE-/-小鼠用高脂饲料喂养并注射HSP65作为感染背景下的AS疾病模型,以辛伐他汀为阳性药研究经过质量检验与肝毒性评价的养阴清热方对血脂、病变及炎症的效应,以及与DC胆固醇代谢的相关性:采用生化试剂盒检测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）及碱性磷酸酶（AKP）水平;HE染色法评价冠状动脉及肝脏病变程度;油红O染色法测定主动脉斑块面积;ELISA法测定血清IL-6、IL-17、IL-22、IL-2、TGF-β、IL-10、GM-CSF及IL-4水平;流式细胞术测定抗凝血中IL-17A+CD4+Th17、Foxp3+CD25+CD4+Treg 及 CD3+CD4+T细胞数量,计算 Th17/Treg 比例;实时荧光定量 PCR（qPCR）法测定脾脏中 Stat3、Stat5a、Jak2、Socs3、Foxp3、Tgfb1、Cd80、Cd86、Nr1h3、Srebf2 和主动脉中 Stat3、Stat5a、Jak2、Socs3、Tgfb1、Cd80、Cd86 mRNA的表达;蛋白质免疫印迹法测定脾脏中磷酸化STAT3（p-STAT3）、磷酸化 STAT5（p-STAT5）、SOCS3、FOXP3 和主动脉中 p-STAT3、SOCS3蛋白表达;免疫荧光法测定脾脏中MHC-Ⅱ+ CD11c+ DC数量及CD80在其中表达水平。从ApoE-/-小鼠体内原代提取骨髓细胞,并诱导其分化为骨髓DC（BMDC）,筛选出养阴清热方中影响ApoE-/-BMDC胆固醇代谢的有效成分:用CCK-8法筛选出养阴清热方中几种主要成分在ApoE-/-BMDC的剂量与孵育时间;NBD胆固醇法筛选出影响牛磺胆酸钠（NaTC）介导的ApoE-/-BMDC胆固醇外流的有效成分及剂量;qPCR法研究这些有效成分对NaTC存在下胆固醇负载的ApoE-/-BMDC中胆固醇代谢基因Nr1h3、Srebf2、Abca1、Abcg1水平的影响。基于NaTC介导的胆固醇外流模型下,研究筛选出的有效成分对ApoE-/-BMDC炎性行为的影响:流式细胞术测定ApoE-/-BMDC中MHC-Ⅱ+CD11c+细胞数量及CD80和CD86在MHC-Ⅱ-CD11c+细胞中的表达;ELISA法测定ApoE-/-BMDC分泌的IL-6、IL-2及TGF-β1水平;将T细胞与有效成分处理后的胆固醇外流ApoE-/-BMDC模型共同培养后,流式细胞术测定CD44hiCD62Llo活化T细胞及CD44lo CD62Lhi na?ve T细胞数量,ELISA法测定T细胞分泌的IL-17A、IL-22、TGF-β1 和 IL-10 水平。研究结果养阴清热方能显著改善ApoE-/-小鼠冠状动脉的形变及主动脉斑块的形成,且质量检测结果良好。养阴清热方能够调节血脂TC、TG、LDL-C、HDL-C及血清炎症因子IL-6、IL-22、IL-2、IL-10和GM-CSF的水平,降低外周血中升高的Th17/Treg比例及CD3在CD4+T细胞中的表达,抑制主动脉中亢进的共刺激分子CD80的转录,恢复脾脏和主动脉中上调的p-STAT3和脾脏中下调的SOCS3水平,上调脾脏p-STAT5和FOXP3水平和主动脉SOCS3水平,并能抑制脾脏中DC的增殖及成熟,恢复Nr1h3转录水平。此外,与辛伐他汀相比,养阴清热方处理的肝脏中单核细胞浸润较少,血清AST、ALT和AKP水平较低。养阴清热方的主要成分中,40-80 μM二苯乙烯苷与5-10 μM白藜芦醇能促进NaTC介导的ApoE-/-BMDC胆固醇外流。基于NaTC介导的胆固醇外流模型,二苯乙烯苷能下调ApoE-/-BMDC中Nr1h3的表达,白藜芦醇能下调Nr1h3、上调Srebf2,二苯乙烯苷与白藜芦醇都能上调Abca1的表达。NaTC存在下,二苯乙烯苷与白藜芦醇能抑制胆固醇聚集ApoE-/-BMDC的成熟,减弱亢进的抗原递呈及共刺激效应。此外,二苯乙烯苷恢复了 NaTC存在下ApoE-/-BMDC中亢进的IL-6分泌水平,上调了 TGF-β1的分泌;白藜芦醇恢复了受抑的IL-2在ApoE-/-BMDC中的分泌,抑制了 IL-6过多的分泌。NaTC介导的胆固醇外流模型下,二苯乙烯苷与白藜芦醇处理的ApoE-/-BMDC下调了亢进的CD44hi CD62Llo活化T细胞水平,且共培体系中T细胞低迷的IL-10和亢进的IL-22分泌水平得以恢复,TGF-β1的水平被上调,二苯乙烯苷处理的ApoE-/-BMDC还抑制了 IL-17A在T细胞中的分泌。结论与意义养阴清热方能改善HSP65攻击下高脂饮食ApoE-/-小鼠的高脂血症及AS病变,且肝毒性低于降脂药辛伐他汀。这些效应可能通过调节DC的胆固醇代谢抑制其抗原递呈、共刺激效应及成熟,进而控制T细胞活化,以及调控IL-6-p-STAT3及IL-2-p-STAT5信号干预Th17及Treg细胞分化实现。养阴清热方的活性成分中,二苯乙烯苷与白藜芦醇能通过上调Abca1增强NaTC介导的ApoE-/-DC的胆固醇外流,改善胆固醇聚集ApoE-/-DC亢进的抗原递呈、共刺激作用及T细胞活化能力,抑制其成熟,并调节共培T细胞的炎性功能。这些发现提示了养阴清热方治疗感染合并高脂饮食背景下AS的有效性,也证明了养阴、清热、活血并治内伤杂病的科学性,为组方在国内外临床的使用提供了理论基础。