卵巢癌主要来源于卵巢上皮组织,是妇科死亡率最高的恶性肿瘤,约2/3的病人就诊时已到临床晚期,5年生存率仅20～30%,然而,其早期的生存率却能接近90%。这主要缘于在早期,无论是通过生物标记物、影像学还是其他方法,都没有有效的诊断方法。同时,卵巢癌具有独特的生长和转移规律,表现在癌细胞于腹膜间皮细胞间黏附、种植、形成转移灶,最终由于腹腔广泛病灶累及网膜、胃肠道和肝脾等脏器而致患者死亡。然而,卵巢癌的发生、发展及转移机理尚不明确。因此,对于疾病发生及发展过程的理解将有助于我们早期识别卵巢癌及发现新的、有效的治疗方法。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)是新近发现的一种细胞间磷脂类信号分子,它通过G蛋白偶联受体引起多种生物学效应。卵巢癌患者腹水和血浆中LPA水平升高。研究证实,卵巢癌细胞可以产生LPA,LPA通过诱导许多与血管生成和转移相关的基因的表达,有助于卵巢癌细胞的增殖、促进肿瘤细胞的浸润和转移,并参与血管生成的调节以及肿瘤细胞耐药的形成。肿瘤转移是一个复杂的,连续的,多阶段过程,研究表明,卵巢上皮性癌选择性的表达趋化因子CXCL12与其特异性受体CXCR4与肿瘤的进展密切相关, CXCL12与CXCR4所构成的CXCL12-CXCR4生物轴(CXCL12-CXCR4 biological axis)直接有助于卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并在合适的条件下形成促肿瘤细胞因子网络,有助于肿瘤细胞的免疫逃逸。目的:本课题从临床入手,首先检测LPA在卵巢癌患者血浆和腹水中的表达,继而体外实验探讨LPA对CXCL12-CXCR4生物轴的调节作用以及LPA调节CXCL12-CXCR4生物轴后对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭、分泌的影响和Gi蛋白抑制剂Pertussis toxin(PTX)对此影响的抑制作用。最后,动物模型进一步证实结论。本课题从临床到基础,从体外到体内,逐层深入地探讨LPA在卵巢癌腹腔转移中的作用及机制,为阻断卵巢癌腹腔转移提供理论依据。方法:本课题分为三部分:1 LPA在卵巢上皮性癌诊断和病情检测中的价值。采用北京泰福仕公司生产的LPA试剂盒对初治40例卵巢上皮性癌,20例良性上皮性卵巢肿瘤患者的血浆和20例卵巢上皮性癌患者的腹水及20例良性上皮性卵巢肿瘤患者的腹腔冲洗液测定LPA水平。其中包括20例卵巢癌患者手术前及术后的血浆LPA水平。同时测定良恶性卵巢肿瘤患者同期血清CA125水平。分析LPA在卵巢上皮性癌诊断和病情检测中的价值并与患者年龄、肿瘤病理类型、手术病理分期、病理分化、CA125等的关系。2 LPA对CXCL12-CXCR4生物轴的调节作用及LPA调节CXCL12-CXCR4生物轴后对卵巢癌细胞的增殖、迁移、侵袭、分泌的影响及机制。培养卵巢癌细胞株CAOV3和SKOV3,免疫细胞化学方法检测两种细胞膜上的CXCR4蛋白表达。不同浓度的LPA刺激卵巢癌细胞,分别作用不同的时间后,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫细胞化学和流式细胞技术检测卵巢癌细胞膜上CXCR4的表达变化,采用ELISA方法检测细胞上清中CXCL12的变化。采用MTT比色法,判断LPA、CXCL12和LPA作用CXCL12后对卵巢癌细胞增殖的影响。以Transwell侵袭小室为模型,应用Matrigel探讨LPA、CXCL12和LPA作用CXCL12后对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响。ELISA法用于测定在LPA、CXCL12和LPA作用CXCL12后,卵巢癌细胞分泌VEGF的变化。同时,观察Gi蛋白抑制剂PTX对此影响的抑制作用。3溶血磷脂酸对卵巢癌细胞在移植瘤动物模型中生长转移和相关因子表达的影响。将6×106个未经处理的卵巢癌细胞株SKOV3(对照组)和用LPA刺激后的SKOV3细胞(LPA处理组)分别注入裸鼠腹腔,每组10只,自移植肿瘤后第二天起,LPA处理组裸鼠每日腹腔注射LPA 0.134mg/20g,对照组裸鼠每日腹腔注射等量的生理盐水,共13天。待裸鼠自然死亡后,观察移植瘤大小、质量、腹腔转移情况。免疫组化和流式细胞技术分析两组移植瘤组织中的VEGF、MMP2、COX-2和CXCR4的蛋白表达变化。结果:1①卵巢癌患者手术前血浆LPA值5.89±1.98μmol/L,明显高于良性对照组平均值1.65±0.71μmol/L,两组相比有显著性差异(p<0.001)。②LPA对于卵巢癌诊断的阳性率为97.5%,明显高于CA125的阳性率77.5%,且特异性80%(16/20)也优于CA125的特异性40%(8/20)。卵巢癌患者手术前血浆LPA和CA125水平相关性比较,二者有相关性,且呈正相关(相关系数r=0.736,p<0.01)。③卵巢癌患者血浆的LPA水平在不同的肿瘤病理类型、手术病理分期和病理分化方面各组相比都无显著性差异(p>0.05)。④所有卵巢癌患者手术后LPA水平2.87±1.34μmol/L均明显低于术前5.89±1.98μmol/L,两者相比有显著性差异(p<0.001)。⑤所有卵巢癌患者腹水LPA水平均值(5.68±1.75μmol/L),明显高于良性腹腔冲洗液的LPA水平(1.34±0.77μmol/L),两者相比有显著性差异(p<0.001)。⑥20例卵巢癌患者中有13例患者腹水LPA水平高于其血浆水平,且腹水LPA水平均值5.68±1.75μmol/L高于血浆LPA水平均值5.346±1.93μmol/L,但两者相比差异无显著性(p>0.05)。2①免疫细胞化学结果显示,卵巢癌细胞CAOV3和SKOV3,在细胞膜和细胞质中均有CXCR4蛋白表达。②RT-PCR、免疫细胞化学和流式细胞技术结果显示,不同浓度(0、5、20)μM的LPA刺激细胞24h,以及20μMLPA在不同的时间(0、12h、24h)作用于细胞后,CXCR4的mRNA和蛋白表达水平均高于对照组,且20μMLPA组高于5μMLPA组,24h组高于12h组,各组相比差异有显著性(p<0.01)。③ELISA方法检测结果显示,在不同浓度的LPA刺激细胞后作用不同的时间,卵巢癌细胞上清的CXCL12表达水平同CXCR4一样升高。④在无牛血清条件下,100ng/mlCXCL12可刺激卵巢癌细胞CAOV3和SKOV3增殖(p<0.05),将20μMLPA与100ng/mlCXCL12结合作用细胞24h后,增殖作用明显增强(p<0.05),同时使用Gi蛋白抑制剂PTX后,增殖作用又趋于减弱(p<0.05)。表明LPA具有促进CXCL12对卵巢癌细胞增殖的作用。⑤100ng/mlCXCL12对卵巢癌细胞CAOV3和SKOV3的迁移有明显的趋化性(p<0.05),结合了20μMLPA后,对细胞的趋化作用更强,迁移的细胞数较单独使用CXCL12显著增多(p<0.05)。Gi蛋白抑制剂PTX,使迁移的细胞数较前减少,证明LPA可以加强CXCL12的趋化作用。在无牛血清培养液作为对照时,卵巢癌细胞CAOV3和SKOV3穿过Matrigel的细胞数很少,100ng/mlCXCL12刺激后,穿过Matrigel的细胞数较前增多(p<0.05),加入20μMLPA后,作用明显增强(p<0.05),但是随着Gi蛋白抑制剂PTX的加入,穿过Matrigel的细胞数又有所减少(p<0.05)。说明LPA可以促进CXCL12对卵巢癌细胞的侵袭作用。⑥100ng/mlCXCL12可使卵巢癌细胞CAOV3和SKOV3分泌VEGF增多(p<0.05),LPA作用于CXCL12后,可以加强这一作用(p<0.05)。3①未经处理的SKOV3细胞移植裸鼠后平均在13.75±1.04天腹腔移植瘤形成,平均生存期27.63±1.92天。LPA处理的SKOV3细胞移植裸鼠后于12.88±1.25天在腹腔形成移植瘤,肿瘤形成日期与对照组相比无明显差别(p>0.05),LPA处理组裸鼠平均生存期23.57±2.37天,明显低于对照组裸鼠(p<0.05)。②两组荷瘤裸鼠自然死亡后解剖腹腔后显示,均于左下腹形成腹腔移植瘤,成瘤率100%。对照组裸鼠的腹腔大网膜、肠系膜有轻度粘连,腹腔转移灶多见,以腹膜和横隔下为主,平均为12.3±4.56个。LPA组裸鼠的腹腔大网膜、肠系膜均发生重度粘连,移植瘤与肝脏、脾脏和肠管粘连紧密,腹腔转移灶也以腹膜和横隔下为主,平均16.3±4.06个,明显多于对照组,有显著性差异(p<0.05)。③对照组裸鼠腹腔移植瘤的平均重量是2.91±0.87g,LPA处理组的平均瘤重3.81±1.04g,明显大于对照组(p<0.05)。④免疫组化和流式细胞技术结果显示,LPA处理组的移植瘤组织中VEGF、MMP2、COX-2和CXCR4蛋白表达水平均高于对照组(p<0.05)。表明LPA具有促进卵巢癌细胞在腹腔内增殖和浸润转移的作用,该作用可能与促进癌组织VEGF、MMP2、COX-2和CXCR4的表达有关。结论:溶血磷脂酸可能成为诊断卵巢上皮性癌的新的生物学指标,同时用于监测病情。卵巢癌患者腹水中有高水平的LPA,LPA可以诱导卵巢癌细胞分泌CXCL12和CXCR4,从而促进卵巢癌细胞的增殖、迁移、侵袭和分泌。因此LPA可以通过上调CXCL12-CXCR4生物轴的作用来促进卵巢癌的腹腔转移。