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背景和目的:非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除外酒精以及其他明确病理损伤因素所致的肝细胞内脂质过度沉积的病理综合征。研究表明胰岛素抵抗在NAFLD众多致病因素中具有重要作用,并贯穿(或参与)NAFLD发生发展的始终。因此探索胰岛素对脂质从头合成的调节机制,对深入了解NAFLD的发病机理有重要的意义。固醇调控原件结合蛋白(Stero responsive element binding protein,SREBP-1c)是胰岛素依赖调控脂质合成的重要转录因子。碳水化合物反应原件结合蛋白)(Carbohydrate responsive element binding protein,Ch REBP)不仅是葡萄糖依赖也是胰岛素依赖的调控脂质合成的关键转录因子。在胰岛素刺激下SREBP-1c和Ch REBP均能诱导脂质从头合成关键酶-脂肪酸合成酶(Fatty acids synthase,FASN)转录激活。FASN基因被过度转录激活是导致肝细胞脂肪变的重要基础。正常状态下染色质处于致密状态会阻止基因转录激活,组蛋白修饰能在不改变DNA序列的情况下,通过影响组蛋白与DNA之间的相互作用,即改变染色质的疏松或凝集转态,为信号分子与靶基因结合提供空间,最终起到调控基因转录的作用。在胰岛素刺激下SREBP-1c及Ch REBP介导的FASN转录激活的过程中也必然存在组蛋白修饰,但是其具体种类及机制仍不清楚。本研究对由FASN基因过度转录激活而导致的肝细胞脂肪变具有重要意义,亦为NAFLD潜在的治疗靶点提供新的证据。鉴于此,本课题首先建立高浓度胰岛素诱导的肝细胞脂肪变模型,并在此基础上探讨高浓度胰岛素对肝细胞FASN基因启动子区域组蛋白修饰的影响,以及FASN基因转录激活与这些组蛋白修饰的关系,SREBP-1c和Ch REBP对胰岛素刺激下FASN基因启动子区组蛋白修饰的作用。最后我们深入研究了组蛋白乙酰化修饰如何影响肝细胞FASN基因的转录表达,从而导致肝细胞脂变的可能机制。方法:一、胰岛素介导的FASN基因启动子肝细胞区组蛋白修饰、基因转录与肝细胞脂质沉积的关系1、胰岛素刺激Hep G2和原代肝细胞的最佳浓度。按照文献报道设置胰岛素浓度:0.5、0.75、1.0、1.25u M分别刺激Hep G2和原代肝细胞24h,MTT检测细胞活性。2、胰岛素对肝细胞脂质沉积的影响。最佳浓度胰岛素干预Hep G2细胞和原代肝细胞24和48h后用TG酶法检测TG含量,油红O染色检测脂滴沉积。3、胰岛素对肝细胞FASN基因转录及表达的影响。最佳浓度胰岛素分别刺激Hep G2、原代肝细胞0、1、2、4、8、12、16、24h,或胰岛素刺激Hep G2、原代肝细胞12h或4h后撤除胰岛素刺激,在胰岛素刺激或撤除刺激的0、1、2、4、8、12、16、24h,分别用q RT-PCR检测FASN m RNA表达,用Western-blot检测各时间点FASN蛋白表达。4、胰岛素刺激Hep G2细胞和原代肝细胞后FASN基因启动子区域的染色质重塑事件。根据胰岛素刺激或撤除胰岛素刺激后FASN转录时间谱,选取FASN m RNA开始增加或者降低的时间点作为研究染色质重塑的时间点。通过染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)技术,利用抗组蛋白H3K4甲基化、H3K9甲基化、H4K20甲基化、H3S10磷酸化、H3乙酰化、H4乙酰化抗体、比较胰岛素作用对FASN基因转录起始点5’上游-2000bp、tss、第二外显子(exon2)组蛋白甲基化、磷酸化、乙酰化修饰的影响。二、SREBP-1c或Ch REBP对胰岛素刺激下FASN基因启动子区域组蛋白修饰的影响1、胰岛素刺激对肝细胞SREBP-1c、Ch REBP蛋白表达的影响最佳浓度胰岛素刺激Hep G2和原代肝细胞0、1、2、4、8、12、16、24h,用Western-blot检测各组细胞SREBP-1c及Ch REBP表达水平。2、胰岛素刺激肝细胞后SRBEP-1c、Ch REBP核转位最佳浓度胰岛素刺激肝细胞0h、24h,免疫荧光检测SREBP-1c、Ch REBP细胞内定位。3、抑制肝细胞SREBP-1c或Ch REBP表达对FASN表达的影响si RNA-SREBP-1c、si RNA-Ch REBP质粒瞬时转染Hep G2细胞,sh RNA-SREBP-1c、sh RNA-Ch REBP慢病毒转染原代肝细胞。Western blot检测Ch REBP、SREBP-1c以及FASN蛋白表达。4、抑制肝细胞SREBP-1c或Ch REBP表达对胰岛素刺激下肝细胞SREBP-1c-SRE、Ch REBP-Ch ORE结合水平的影响si RNA-SREBP-1c、si RNA-Ch REBP质粒瞬时转染Hep G2细胞,sh RNA-SREBP-1c、sh RNA-Ch REBP慢病毒转染原代肝细胞。Ch IP比较空白组、阳性对照组(最佳浓度胰岛素刺激)、转染组、阴性对照组(转染p EX3-scramble质粒或阴性对照慢病毒后用胰岛素刺激)FASN基因启动子区域SREBP-1c-SRE、Ch REBP-Ch ORE结合水平。5、SREBP-1c和Ch REBP对胰岛素刺激下肝细胞FASN基因启动子区组蛋白修饰的影响si RNA-SREBP-1c、si RNA-Ch REBP质粒瞬时转染Hep G2细胞,sh RNA-SREBP-1c、sh RNA-Ch REBP慢病毒转染原代肝细胞。Ch IP比较空白组、阳性对照组(最佳浓度胰岛素刺激)、转染组、阴性对照组(转染p EX3-scramble质粒或阴性对照慢病毒后用胰岛素刺激)FASN基因启动子区域组蛋白修饰事件。三、组蛋白乙酰化修饰对胰岛素刺激下肝细胞脂肪变性的影响Hep G2、原代肝细胞分为空白组、胰岛素组(胰岛素刺激Hep G2细胞12h,刺激原代肝细胞8h)、胰岛素+组蛋白乙酰化酶抑制剂(Histong acetyltransrease,HAT)组。根据文献报道以及前期实验结果,选取5u M作为Garcionl处理肝细胞最适浓度。Ch IP检测FASN基因启动子区域H3、H4乙酰化修饰以及SREBP-1c-SRE、Ch REBP-Cho RE结合水平。Western-blot检测FASN、SREBP-1c、Ch REBP表达水平。Hep G2和原代肝细胞用胰岛素刺激48h以及Garcionl与胰岛素共刺激48h后油红O检测细胞内脂滴。结果:一、胰岛素介导的FASN基因启动子肝细胞区组蛋白修饰、基因转录与肝细胞脂质沉积的关系1、MTT结果显示:1.25u M为胰岛素刺激Hep G2细胞和原代肝细胞最适浓度。2、Western blot结果显示:胰岛素刺激下,Hep G2细胞和原代肝细胞内FASN蛋白水平随着刺激时间延长而表达增加(p<0.05)。3、TG及油红O测定显示:1.25u M胰岛素刺激Hep G2细胞和原代肝细胞24及48h后,肝细胞内TG及脂滴含量均较0h明显增加(p<0.05)。证明胰岛素诱导肝细胞脂肪变模型构建成功。4、q RT-PCR结果显示:当1.25u M胰岛素刺激Hep G2细胞4h时,细胞内FASN m RNA转录水平较0h明显增高,至12h时,FASN m RNA转录水平到达峰值(P<0.05)。1.25u M胰岛素刺激Hep G2细胞12h时撤除胰岛素刺激,在撤除胰岛素刺激1h时,FASN m RNA转录水平较0h明显下降(P<0.05)。当1.25u M胰岛素刺激原代肝细胞1h时,细胞内FASN m RNA转录水平较0h明显增高,至4h时,FASN m RNA转录水平到达峰值(P<0.05)。1.25u M胰岛素刺激原代肝细胞4h时,撤除胰岛素刺激,在撤除胰岛素刺激1h时,FASN m RNA转录水平较0h明显下降(P<0.05)。由于染色质重塑事件一般发生在基因转录早期,因此我们选择胰岛素刺激Hep G2细胞4h、撤除胰岛素刺激1h;胰岛素刺激原代肝细胞1h、撤除胰岛素刺激1h,作为研究胰岛素介导的FASN基因启动子区域组蛋白修饰时间的时间点。5、Ch IP结果显示:胰岛素分别刺激Hep G2或原代肝细胞4h或1h后,与0h相比,此时FASN m RNA转录出现明显上调,FASN基因启动子区域tss位点H3K4三甲基化、H3S10磷酸化、H3乙酰化、H4乙酰化水平显著升高(P<0.05),而H3K9三甲基化、H4K9三甲基化水平下降(P<0.05)。-2kb以及exon2位点无明显改变(P>0.05)。胰岛素分别刺激Hep G2和原代肝细胞12h和4h后撤除刺激,相比0h,在撤除刺激1h后FASN m RNA转录水平明显下调,FASN基因启动子区域tss位点H3K4三甲基化、H3S10磷酸化、H3乙酰化、H4乙酰化水平降低,H3K9三甲基化、H4k20三甲基化水平明显升高(P<0.05)。-2kb和exon2位点无明显改变(P>0.05)。二、SREBP-1c或Ch REBP对胰岛素刺激下FASN基因启动子区域组蛋白修饰的影响1、Western-blot结果显示:胰岛素刺激Hep G2或原代肝细胞后,SREBP-1c及Ch REBP蛋白水平明显升高,且随着时间的延长而表达增加。在Hep G2细胞中SREBP-1c表达在8h开始升高,Ch REBP表达在4h开始升高。在原代肝细胞中SREBP-1c表达在1h开始升高,Ch REBP表达在2h开始升高。2、Western-blot结果显示:抑制Hep G2细胞及原代肝细胞中SREBP-1c或Ch REBP表达后,即使分别再予12h及4h的胰岛素刺激,SREBP-1c或Ch REBP抑制组FASN蛋白表达水平仍较胰岛素刺激组明显受抑制。说明胰岛素需通过SREBP-1c或Ch REBP调控FASN的表达。3、免疫荧光结果显示:1.25u M胰岛素刺激Hep G2细胞及原代肝细胞各24h后,细胞核中的绿色荧光较正常组明显增多,即胰岛素刺激促进SREBP-1c、Ch REBP由胞浆转位至胞核中。4、Ch IP结果显示:在1.25u M胰岛素刺激下,抑制Hep G2和原代肝细胞SREBP-1c或Ch REBP蛋白表达,与胰岛素刺激组相比,FASN基因SREBP-1c-SRE、Ch REBP-Cho RE结合水平均明显降低(p<0.05)。5、Ch IP结果显示:抑制Hep G2和原代肝细胞中SREBP-1c表达,FASN基因tss、SRE位点H3乙酰化及H4乙酰化水平较阳性对照组明显下降(P<0.05)。而H3K4三甲基化修饰则无明显下降。而抑制Hep G2和原代肝细胞中Ch REBP表达FASN基因tss、Ch ORE位点H3乙酰化及H4乙酰化水平较阳性组明显下降(p<0.05)。H3K4三甲基化同样无明显下降。同时抑制SREBP-1c和Ch REBP,FASN基因tss位点H3及H4乙酰化水平下降较单独抑制SREBP-1c或Ch REBP下调更加明显。结果提示FASN基因启动子区H3K4修饰水平并非仅受SREBP-1c和Ch REBP影响,而H3和H4乙酰化修饰水平则主要受SREBP-1c和Ch REBP影响。且SREBP-1c及Ch REBP协同参与了胰岛素刺激下肝细胞FASN基因启动子区组蛋白修饰。三、组蛋白乙酰化对胰岛素刺激下肝细胞脂肪变的影响1、Ch IP结果显示:在胰岛素刺激下同时抑制HAT活性,能显著下调胰岛素诱导的Hep G2及原代肝细胞FAS基因启动子区域H3、H4乙酰化水平(P<0.05)。2、Ch IP结果显示:在胰岛素刺激下同时抑制HAT活性,能降低Hep G2细胞及原代肝细胞Ch REBP-Ch ORE结合水平(P<0.05)。3、Western-blot结果显示:在胰岛素刺激下同时抑制HAT活性,与胰岛素刺激组相比较,抑制组肝细胞FASN蛋白上调幅度明显降低,而SREBP-1C和Ch REBP表达水平则无明显改变。4、油红染色显示:在胰岛素刺激下同时抑制HAT活性,细胞内脂滴较单纯胰岛素刺激组减少。结论:1.25u M胰岛素可诱导Hep G2细胞和原代肝细胞脂肪沉积。胰岛素刺激能促进FASN基因转录,同时伴随FASN基因启动子区域组蛋白H3K4三甲基化、H3S10磷酸化、H3乙酰化、H4乙酰化升高,H3K9及H4K20三甲基化水平降低,胰岛素撤除后FASN基因转录降低,FASN基因启动子区域组蛋白H3K4三甲基化、H3乙酰化、H4乙酰化降低,H3K9及H4K20三甲基化水平升高。胰岛素通过调控SREBP-1c以及Ch REBP表达来影响FASN基因转录表达,而SREBP-1c或Ch REBP则通过增强与FASN基因启动子调控区域SRE或Ch ORE结合并诱导FASN基因H3、H4乙酰化,发挥对FASN基因的调控作用。在胰岛素作用下,Garcinol抑制HAT活性并不能抑制SREBP-1c或Ch REBP的表达,而是通过干扰SREBP-1c和Ch REBP与FASN基因启动子区域SRE、Ch ORE结合,降低其转录活性进而干扰FASN蛋白的表达。说明组蛋白乙酰化修饰是胰岛素刺激下SREBP-1c及Ch REBP介导的FASN转录调控的重要机制之一。