细胞凋亡，又称程序性死亡，具有广泛及重要的生理和病理意义，由多种促进细胞死亡或延长细胞生存的基因及其产物所调控。目前认为调节细胞凋亡的相关基因主要有：抑制凋亡基因、促进凋亡基因、以及细胞凋亡过程中表达的基因。现已知道凋亡与恶性肿瘤、造血系统疾病，感染性疾病等多种疾病的发生发展密切相关。研究者已经尝试通过调节细胞凋亡机制的核心成份，例如BCL2蛋白家族、细胞内抗凋亡蛋白，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)，以及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspases)等来诱导癌细胞的凋亡。几种凋亡诱导剂已应用于癌症的治疗，并显示出较好的应用前景。对肿瘤凋亡机制深入研究，其最终目的一方面是为化学治疗提供更多、有效、特异的治疗靶点；另一方面通过调节和控制凋亡的过程，克服和解决肿瘤治疗中的耐药性问题，提高临床疗效。在凋亡研究过程中，每一个与凋亡密切相关的新基因的发现，都会深化人们对凋亡机制的了解，引发人们对许多疾病发生、发展进行新的思考。朱峰等人通过建立急性早幼粒白血病细胞(HL-60)凋亡模型，运用改良消减杂交法(ISH)克隆出了一系列新基因，认为与细 第四军医大学硕士学位论文胞凋亡相关，分别命名为apr一1一即r一5，并在GeneBank中登录。aPr一2是其中之一，全长79lbp，位于第17号染色体，其eDNA编码区为339bp，编码In个氨基酸。但该基因的结构、功能以及与细胞凋亡的确切关系目前还不清楚，国内外文献尚无研究报道。 我们通过克隆apr一2编码区基因，.获得APR一2原核表达蛋白和抗血清，为进一步对该基因的研究莫定基础。本研究进行了如下四方面实验:1.利用全反式维甲酸(ATRA)建立HL一60细胞凋亡模型，提取HL一60凋亡 细胞总RNA，根据GeneBank中apr一2 CDNA编码区序列设计引物，采 用RT一PCR方法获取apr一2 cDNA编码区序列，回收纯化后与PGEM--T Easy载体连接，转化大肠杆菌，构建重组克隆载体PGEM一T Easy/apr一2， 进行序列分析。2.测序正确后，将目的片段亚克隆入PGEX一4T一2原核表达载体，转化大 肠杆菌，异丙基硫代一p一D一半乳糖昔(IPTG)诱导重组融合蛋白小样 表达，确定目的基因的表达情况后，进一步大量表达，利用凝胶自动 扫描分析目的蛋白在细菌中的表达分布。运用电洗脱方法对获得的融 合蛋白进行初步纯化。3.用获得的融合蛋白免疫新西兰大白兔，制备兔多克隆抗血清，饱和硫 酸胺法纯化，酶联免疫反应(EL工SA)检测抗血清滴度，运用 western一blot检测融合蛋白的免疫原性。4.全反式维甲酸培养HL一60细胞12h后，提取细胞总蛋白，利用制备的 兔多克隆抗血清，对APR一2进行western一blot检测。 结果:提取的HL一60凋亡细胞总RNA，经RT一PCR后，获得一条约339bp的DNA电泳条带，产物分别与PGEM一T Easy和PGEX一4T一2载体连接并转化大肠杆菌后得到阳性克隆，经序列分析表明，与GeneBank中已登录的apr一2 cDNA编码区序列完全一致。证明我们成功地构建了重组克隆载体PGEM一T一Easy/apr一2和原核表达载体PGEX一4T一2/aPr一2。将载有目的片段的PGEX一4T一2重组表达载体，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导融合蛋白GST一APR一2表达，凝胶自动扫描分析显示表达的融合蛋白占菌体总蛋白的30%以上，主要以包涵体的形式存在。用融合蛋白免疫新西兰大白兔，获得兔多克隆抗血清，间接ELISA检测抗血清效价约为1:5000。用Western一blot检测抗原(纯化的蛋白质)的免疫原性，显示原核表达的 第四军医大学硕士学位论文蛋白可与多克隆抗血清特异的结合，形成单一的结合条带，且上样量与免疫印迹条带大小呈正相关。利用已制备的兔多克隆抗血清Western一blot检测全反式维甲酸培养12h后的HL一60细胞，在约12KD左右形成清晰的单一条带。 结论:成功地获得了细胞凋亡模型HL一60中aPr一2 cDNA编码区的克隆。成功地进行APR一2的融合表达，并获得了该蛋白的兔多克隆抗血清，对该蛋白在 HL一60凋亡细胞中的表达状态进行初步研究。为aPr一2的功能研究及进一步阐明细胞凋亡的机制奠定基础。