背景脑血管病的高发病率、高致残率、高复发率、高死亡率对人类健康的危害依然高居前位。神经干细胞(neural stem cells, NSCs)移植被认为是二十一世纪较具前景的医疗技术,但因NSCs的来源受限、取材困难、免疫排斥、安全性和伦理学等众多问题使神经干细胞的应用受到制约,尤其是神经干细胞的来源和移植途径成为制约其临床应用的关键。脑梗死后成体神经干细胞的原位激活为内源性神经干细胞移植开辟了新途径,其激活机制有待阐明,前期研究发现脑梗死后神经干细胞原位激活与谷氨酸(glutamate, GLu)浓度有关联。为此,本课题拟通过体外实验,探讨谷氨酸对大鼠神经干细胞增殖作用的影响,为进一步研究内源性神经干细胞原位激活机制提供理论依据。本课题分两部分：第一部分神经干细胞的原代培养和鉴定方法的改良目的体外原代培养SD (Sprague-Dawley)大鼠神经干细胞,对原代培养的神经干细胞、及其增殖和分化的细胞给予鉴定,并对神经干细胞原代培养和鉴定方法进行改良。方法体外原代培养SD大鼠神经干细胞：从出生2天内SD新生大鼠的海马中分离和培养出神经干细胞,经过传代,取第3代神经干细胞球,采用免疫荧光细胞化学技术鉴定神经干细胞特异性标志物nestin(巢蛋白)的表达；向培养基中添加5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)24h后,检测BrdU在增殖神经干细胞中的表达；神经干细胞在有血清的培养基中培养7天,通过检测标志物βⅢ-tubulin、GFAP分别鉴定神经元和星形胶质细胞。结果体外培养的神经干细胞能增殖形成神经干细胞球,其增殖的细胞可检出神经干细胞特异性标志物nestin;培养的细胞能将BrdU结合到细胞核中；改用血清培基后,神经干细胞能分化标志物βⅢ-tubulin阳性的神经元和GFAP阳性的星型胶质细胞。结论1.本实验从SD大鼠海马中分离和培养的细胞,其特异性标志物、增殖和分化能力等方面均具备神经干细胞的基本属性；2.通过实验改良了神经干细胞的原代培养和鉴定方法,提高了原代培养神经干细胞的质量和数量。第二部分谷氨酸对神经干细胞增殖作用的实验研究目的利用体外原代培养的大鼠NSCs,探讨谷氨酸对NSCs增殖作用的影响,为进一步研究内源性神经干细胞原位激活机制提供理论依据。方法取第3代神经干细胞,在含有不同浓度谷氨酸的无血清培养基中培养7天,采用倒置显微镜下细胞计数和细胞活力MTT检测两种方法分别检测不同浓度谷氨酸组神经干细胞增殖情况。结果神经干细胞在无血清神经干细胞培养基中,去除神经营养因子,加入不同浓度的谷氨酸继续培养7天后,倒置显微镜下细胞计数和细胞活力MTT检测结果共同显示低浓度谷氨酸可促进神经干细胞增殖。结论1.无血清体外培养条件下,低浓度谷氨酸可促进神经干细胞的增殖,谷氨酸最佳作用浓度为200μmol/L;2无血清体外培养条件下,高浓度谷氨酸可抑制神经干细胞的增殖,并有一定的细胞毒性。