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肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)是致命的运动神经元疾病,表现为运动神经元广泛死亡,至今缺乏有效治疗方法。人诱导多能干细胞(human induced Pluripotent Stem Cells,hi PSCs)来源广、增殖快,且可以分化为特定运动神经元,为ALS的治疗带来了曙光。然而干细胞治疗仍面临3大难题:数量有限、分化方向不可控制,以及移植到体内的细胞大量死亡。本研究中,我们对hi PSCs进行了多基因修饰:(1)转入Tet-on系统,实现Ngn2、Isl1、Lhx3(NIL)条件性表达,既保留了hi PSCs本身来源广、增殖快的特点,又可以利用药物定向诱导运动神经元分化;(2)过表达抗凋亡因子Bcl-x L,保证移植细胞在体内长期存活。经抗生素筛选获得一株来源广泛、增殖良好的、可定向诱导和抗凋亡的阳性细胞克隆hi PSCs-NIL-BSD+Bcl-LG,该克隆呈GFP阳性,同时高表达荧光素酶标记基因;并且加入四环素诱导后,转基因蛋白Isl1表达水平显著提高。完成阳性细胞克隆鉴定后,我们在培养基中加入四环素体外诱导运动神经元的定向分化,hi PSCs-NIL-BSD+Bcl-LG从干细胞克隆状态高效、迅速分化为神经样细胞,表现为细胞核聚缩和神经突触不断延长。通过免疫荧光和膜片钳技术对神经元进行表征,hi PSCs-NIL-BSD+Bcl-LG所诱导运动神经元广泛表达神经元早期marker MAP2、运动神经元特异性marker HB9和成熟神经元marker Ch AT,并且产生较强的离子电流,说明在四环素诱导下hi PSCs-NIL-BSD+Bcl-LG可以定向分化为功能成熟的运动神经元。此外,在传代应激和谷氨酸毒性实验中,与对照组hi PSCs-NIL-BSD相比,hi PSCs-NIL-BSD+Bcl-LG诱导的神经元存活数目明显增多,展示出Bcl-x L的抗凋亡活性。随后,我们将hi PSCs-NIL-BSD+Bcl-LG直接注射到免疫缺陷小鼠皮下组织,腹腔注射四环素进行体内定向诱导,与PBS对照组相比,四环素诱导后的hi PSCs-NIL-BSD+Bcl-LG在皮下组织没有形成畸胎瘤,且分化为神经样的细胞,大量表达神经元通用markerβ-tubulin。确保其安全后,我们将hi PSCs-NIL-BSD+Bcl-LG注射到免疫缺陷新生鼠的脑室和脊髓中,活体成像技术检测移植细胞能够在体内长期存活(>4周);并且经四环素诱导定向分化为运动神经元,同时表达神经元相关markersβ-tubulin、MAP2、HB9和Ch AT,与体外定向分化的结果相一致,表明hi PSCs-NIL-BSD+Bcl-LG在体内也能够定向分化为运动神经元。综上所述,本研究首次利用多基因修饰技术获得的hi PSCs-NIL-BSD+Bcl-LG,既保留了hi PSCs本身来源广、增殖快的优点,为干细胞移植提供足量细胞来源;又保证了干细胞分化方向的可控性及移植细胞体内存活率。此外,首次把基因修饰的hi PSCs细胞直接注入体内,并在药物诱导下实现hi PSCs体内高效定向分化为运动神经元,有望为ALS等神经退行性疾病的干细胞治疗提供一种新的治疗策略。