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结核病是一种古老的疾病,早在十七世纪就已经存在。目前,由于全世界感染人口基数大,耐药结核病例大大增加和HIV/TB共感染情况严重,结核病正对人类构成巨大的威胁。为了预防结核病,全球已经半个多世纪前广泛接种了卡介苗BCG,但是BCG的免疫保护效果并不理想。随着生物技术的发展,很多新型疫苗正在陆续开发,例如重组卡介苗,减毒疫苗,蛋白疫苗和DNA疫苗等。他们各自都有不同的优势,但是否可以超越BCG的免疫保护效果还有待临床证明。在人群中给予结核杆菌疫苗免疫是防治结核感染、控制局部爆发流行最有效的措施。结核疫苗主要有两大类：活的结核杆菌疫苗和亚单位疫苗。结核亚单位疫苗虽然免疫原性没有活的结核杆菌疫苗强,但其免疫效力不受预先接触环境分枝杆菌和结核分枝杆菌的影响,而且背景清楚,安全性好,制备简单,可以用于成人强化免疫,是控制结核病爆发的理想疫苗。亚单位疫苗有三种形式：蛋白质疫苗、DNA疫苗和以病毒为载体的疫苗[1,2],其中蛋白质疫苗相对最为安全,易于被人们接受。目前,已经有超过20种的不同抗原用于诱导抗结核的免疫应答[3,4].分泌性抗原Ag85a属于Ag85蛋白家族,被认为具有较好的免疫原性。结核杆菌是一种巨噬细胞内寄生菌。结核病的发生与免疫系统密切相关。故人体对结核杆菌感染的免疫,以细胞免疫为主。在抗结核感染中,CD4+和CD8+T细胞起主要作用。结核杆菌活化的T细胞所释放出的淋巴因子,包括白介素-2(IL-2),γ-干扰素(IFN-γ),它们直接或间接杀伤结核杆菌。本研究采用来源于结核杆菌的重要抗原Ag85a和结核免疫相关的细胞因子IFN-y与IL-2,以结核分枝杆菌标准株H37R v基因组DNA为模板,扩增Ag85a基因,分别与鼠源IFN-y和IL-2的基因融合与表达质粒pET28a构建成重组质粒pet28a-Ag85a-IFN-γ和pet28a-Ag85a-IL-2。在大肠杆菌BL21(DE3)中表达去除信号肽的融合蛋白,纯化得到Ag85a—IFN-γ和Ag85a—IL-2的融合蛋白。用该蛋白皮下免疫C57BL/6小鼠,并进行免疫效果评价,以期筛选高效的加强免疫的蛋白亚单位疫苗。通过ELISA方法检测血清中IgG,IgG1和IgG2c水平,我们发现融合蛋白Ag85a-IFN-γ和Ag85a-IL-2实验组的免疫球蛋白水平均高于单独抗原,并且融合蛋白组IgG2c/IgG1的比值大于单独抗原,并且Ag85a—IL-2的免疫保护效果优于Ag85a-IFN-γ;流式细胞术检测胞内特异性CD4+和CD8T+细胞,Ag85a-IFN-γ和Ag85a-IL-2实验组CD8+/CD4+比例高于单独抗原。本实验成功构建并表达了Ag85a-IFN-γ和Ag85a-IL-2的融合蛋白,融合蛋白的免疫效果优于单独Ag85a抗原,并且Ag85a—IL-2的免疫效果优于Ag85a—IFN-y。