为构建具有高效抗菌、活性持久的抗菌基因，探索研制新型抗菌制剂，克服耐药性细菌感染日益严重的问题，本实验室应用重叠区PCR技术对牛奶溶菌酶基因加以改造。在其C端引入BagktI的酶切位点，N端引入BglII和EcoRI酶切位点和终止密码子，并在酶切位点之前添加保护性碱基。去除了部分非a螺旋、β折叠的序列，保留其两个活性部位，并在序列中间引入编码Ser-Gly-Gly柔性连接肽的序列。测序结果显示，PCR产物大小为349bp，编码108个氨基酸，与目的片断大小一致。克隆PCR产物，并构建了pGEX-4T-l-BLY原核表达载体。经BamhI和EcoRI酶切及质粒PCR鉴定，证实本实验构建的新型牛溶菌酶基因已克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上，为进一步研究其诱导表达条件及生物学功能奠定了基础。 将已构建的pG-BLY蛋白表达载体质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，用2<,×>YT培养基培养，以IPTG诱导融合蛋白表达，作SDS-PAGE分析表达情况。结果显示，表达蛋白分子量为38.2kDa，与预期目标带大小一致。将诱导条件经过温度梯度、时间梯度以及IPTG浓度梯度的分析选择进行优化。通过优化原核诱导表达条件，发现GST-BLY蛋白在28<。>C，IPTG终浓度为lmM的条件下诱导5小时，蛋白表达效果较佳。 将菌体反复冻融后超声破碎，将破碎后的上清及沉淀分别作SDS-PAGE分析，发现融合蛋白的表达产物以可溶形式存在。将融合蛋白用GlutathioneSepharose 4B纯化后，进行抑菌实验。用四种标准菌株，即大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC(America Type Culture Collection美国标准菌库)25922，绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC10211，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC26112，肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)ATCC49619检测终浓度为10ug／ml时蛋白的抑茵效果，发现该融合蛋白具有明显的抑制革兰氏阳性茵活性(P<0.05)，优于对照GST蛋白和正常溶菌酶。提示我们所构建的新型牛奶溶菌酶有望成为一种新型高效的抗菌分子，应用于抗菌研究，研制新型抗菌制剂，提高机体抵抗病菌感染的能力。 为了构建一种可能具有抗菌活性，增加或增强溶菌酶活性的新型牛溶菌酶基因，本实验室应用PCR技术对牛奶溶菌酶基因加以改造。去除部分非活性基团的短肽，保留两个活性部位，同时在序列中加上Ser-Gly-Gly柔性连接肽序列，并在两端引入BamHI、BKlⅡ和EcoRI酶切位点，在末端设计终止密码子，克隆PCR产物，并构建了pGEX-4T-1-BLY基因表达载体。经BamHI，EcoRI酶切及质粒PCR鉴定，证实BLY基因己克隆到原核表达载体pGEX-4T-l，为进一步研究其诱导表达条件及生物学功能奠定了基础。 溶菌酶(1ysozyme，LYZ)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解细菌细胞壁中粘多糖的B-1，4-糖苷键的胞壁质酶，常与氯离子结合成为溶酶氯化物，是一种碱性蛋白质，存在于许多动物、植物和微生物中。自上世纪20年代被发现以来，人们对溶菌酶的研究得到了蓬勃发展，已在食品工业、医疗卫生、动物饲养以及包装工业等方面显示出广阔的应用前景。研究发现，溶菌酶对革兰氏阳性细菌具有直接的溶解作用，催化革兰氏阳性菌细胞壁不溶性多糖水解，生成可溶性黏肽。在分泌型免疫球蛋白A和补体的参与下，溶菌酶还对革兰氏阴性细菌具有间接的溶解作用，是一种天然的抗菌物质。由于其能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬和消化功能、将诱发炎症的酸性物质灭活、增强抗菌素及其它药物的疗效，具有消炎消肿、帮助组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用(荣晓花等，1999)，溶菌酶在医疗界中倍受关注。牛体内溶菌酶(bovine lysozyme，bLys)有大约10种，为了探索发现一种新型、高效、安全的抑菌物质，将已构建的BLY蛋白表达载体质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，用2×YT培养基培养，以IPTG诱导融合蛋白表达，并作SDS-PAGE分析表达情况。结果表明，该融合蛋白能在大肠杆菌中能正确转录，经SDS-PAGE分析表达蛋白分子量约为38KD，与预期目标带大小一致。诱导条件经过温度梯度、时间梯度以及IPTG浓度梯度的分析选择，发现在28℃，IPTG终浓度为1mM的条件下诱导5小时，蛋白表达效果较佳。 将菌体反复冻融后超声破碎，将破碎后的上清及沉淀分别作SDS-PAGE分析，发现融合蛋白的表达产物以可溶形式存在。将融合蛋白用GlutathioneSepharose 4B纯化后，进行抑菌实验。用四种标准菌株检测终浓度为10μg/ml时蛋白的抑菌效果。发现该融合蛋白具有一定的抑菌活性，提示我们所构建的新型溶菌酶融合蛋白有望成为一种新型的抗菌物质。