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目的:胶质瘤干细胞(Glioma stem cells,GSCs)是导致临床胶质瘤难以根治、容易复发的主要原因;近年来研究发现50%-80%的WHO Ⅱ级,Ⅲ级以及继发性恶性胶质瘤中伴有异柠檬酸脱氢酶1(Isocitrate dehydrogenasel,IDH1)基因发生突变;本课题的研究目的是以IDH1突变型GSCs为研究对象探讨IDH1基因突变对GSCs辐射敏感性的影响,并初步探讨其作用机制。方法:(1)在干细胞条件培养基下逆分化胶质瘤细胞,细胞培养至第十二代,通过全自动流式细胞分选仪,特异性识别胶质瘤干细胞表面干性标志物蛋白CD133,富集培养后得到GSCs。(2)构建IDH1-R132H突变基因过表达质粒,用Lipofectamine3000脂质体转染法将空载质粒与突变质粒转入胶质瘤干细胞中,得到空载胶质瘤干细胞与IDH1-R132H基因突变胶质瘤干细胞。(3)X射线照射后,采用细胞克隆形成实验和CCK8技术检测IDH1-R132H基因突变型GSCs的细胞增殖活力。(4)利用细胞免疫荧光实验检测对照组和实验组细胞在X射线照射4 Gy后不同时间γH2AX的数量。(5)在胶质瘤干细胞IDH1突变后,X射线照射4 Gy,用自动化流式细胞仪检测IDH1-R132H基因突变GSCs的细胞周期分布。(6)采用Western blot技术检测两组细胞在X射线照8 Gy,2 h后调节磷酸戊糖途径关键蛋白TIGAR的表达水平;(7)进一步采用NADP+/NADPH及谷胱甘肽检测试剂盒分别检测对照组和实验组细胞内NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值。结果:(1)细胞克隆形成实验表明,实验组细胞在X射线照射2、4、6、8 Gy后细胞克隆形成率分别为68.14%、42.07%、19.44%、13.35%,与对照组细胞相比,两组数据差异无统计学意义。(2)CCK8检测结果显示,在X射线照射前,实验组细胞平均OD值是对照组细胞的1.01倍,X射线照射4 Gy,8 Gy后48小时,实验组细胞平均OD值是对照组细胞的1.1倍。(3)细胞免疫荧光实验表明,突变组GSCs在X射线照射4 Gy后0.5 h γH2AX形成的数目迅速增加,2 h时γH2AX foci量迅速下降,4 h时细胞内γH2AX foci几乎消失,在不同时间突变组胶质瘤干细胞γH2AX foci形成的数目与空载组细胞无显著性差异;(4)流式细胞周期实验显示,质粒转染48 h后,对照组细胞周期各时相所占百分比分别为:G1期72.54%,S期18.14%,G2/M期9.32%;实验组细胞周期各时相所占百分比分别为:G1期65.33%,S期25.23%,G2/M期9.44%;X射线照射后,两组细胞各时相分布百分比无统计学差异;(5)Western blot结果显示,与空载组GSCs比较,突变组GSCs在转染基因突变质粒48小时后TIGAR蛋白表达量未明显下降,经8 Gy X射线照射后2 h,两组细胞TIGAR蛋白表达量上升,与未照射组细胞比较,蛋白增加量的差异具有统计学意义,但两组细胞间增加的蛋白量差异不显著。(6)NADP+/NADPH和GSSG/GSH氧化还原检测试剂盒数据显示数,与空载组细胞相比,突变组细胞内还原性物质有所增加,但两组细胞NADPH/NADP+和GSH/GSSG比值的差异不具有统计学意义。结论:与空载组胶质瘤干细胞相比,IDH1-R132H基因突变未对胶质瘤干细胞造成影响。在X射线照射后,IDH1突变型胶质瘤干细胞的细胞增殖活力、DNA损伤修复效率以及胶质瘤干细胞周期G1,S、G2/M等各个时相的分布均未明显改变;IDH1-R132H基因突变后胶质瘤干细胞内还原性物质NADPH、GSH处于升高趋势,但是IDH1-R132H基因突变的胶质瘤干细胞内NADPH/NADP+和GSH/GSSG比值无统计学意义;结果揭示了 IDH1基因突变在胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞中的调控机制不同,IDH1突变增加了胶质瘤细胞的放射敏感性,但是对胶质瘤干细胞的放射敏感性无明显影响;这可能是临床上神经胶质瘤对放化疗不敏感,治疗后容易复发的一个主要原因;本课题从IDH1基因突变的放射生物学角度排除了影响GSCs辐射敏感性的一个重要因素,对临床上解释神经胶质瘤的辐射耐受性具有一定的科学意义和应用价值。