TSG101、P21^WAF1／CIPI及P300／CBP在肺鳞癌和肺腺癌中的表达及意义前言人TSG101（tumor susceptibility gene101）基因定位于11P15.1-15.2，cDNA全长1494bp，由6个外显子和5个内含子组成，其编码产物为含380个氨基酸分子量43KD的蛋白质。Stathmin蛋白可与TSG101蛋白的α螺旋形成的螺旋卷曲结构（CC2）相结合，并使TSG101蛋白磷酸化^[1-2]，TSG101可能通过这种磷酸化作用进行转录调控。此外，TSG101参与泛素介导的蛋白降解过程，以UBC显性负性突变体形式起作用。人于经TSG101基因失活处理而发现恶性转化细胞NIH3T3成纤维细胞虽经恢复TSG101基因活性，部分细胞的恶性转化并未逆转。这说明TSG101基因失活可以增加基因组的不稳定性，促成肿瘤发生。目前在髓细胞白血病，淋巴瘤，前列腺癌，宫颈癌中均有关于TSG101的报道，尽管研究结果不甚一致，但可以肯定TSG101在肿瘤发生发展中发挥重要作用。Oh等报道在HEK293F细胞中分化原始的角化细胞，TSG101蛋白结合cyclin依赖激酶CDK抑制剂P21^WAF1／CIPI，在增生的角化细胞中增加了的TSG101表达不影响P21^WAF1／CIPI水平但是引起重要的生长抑制，大部分是以P21^WAF1／CIPI依赖的。有研究表明，TSG101无论在体内体外作用于荷尔蒙受体激活剂P300／CBP，从而影响肿瘤在前列腺，乳腺和其他组织的生长。目前，关于TSG101与肺癌的关系及TSG101与P21^WAF1／CIPI、P300／CBP在肺癌中表达的相关性研究，国内外报道尚少。为此，本实验通过免疫组化和Western Blotting方法检测TSG101和P300／CBP及P21^WAF1／CIPI在肺鳞癌和肺腺癌中的表达情况，分析三者之间的关系及它们临床病理参数之间的关系，为阐明肺癌发生机制和寻找治疗肺癌的方法提供依据。材料和方法1、材料收集79例肺癌组织（鳞癌48例，腺癌31例），其中53例肺癌取自辽宁省肿瘤医院1980—2001年手术切除存档蜡块。另外26例新鲜肺癌组织及26例新鲜癌旁正常肺组织取自中国医科大学附属第一临床医院胸外科2006年5月—2006年7月手术切除标本。2、主要试剂和来源浓缩型鼠抗人TSG101单克隆抗体（sc-7964）购自美国Santa Cruz公司，浓缩型辣根酶标记山羊抗小鼠（ZB-2305），浓缩型DAB（ZLI-9302）试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，P21^WAF1／CIPI鼠抗人单克隆抗体工作液（MAB-0235），即用型S-P超敏免疫组化试剂盒（SP-900／9001／9002）均购自福建迈新生物技术有限公司，梯度蛋白标准（#SM0441）购自MBI公司，P300／CBPAb-1（cloneNM11）浓缩型鼠抗人单克隆抗体购自Neomarkers公司。3、方法（1）免疫组织化学染色检测TSG101、P21^WAF1／CIPI和P300／CBP的表达，采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法（S-P法）。细胞内呈现棕黄色细小颗粒者为阳性染色。TSG101蛋白定位于肺泡上皮细胞浆（胞核）或癌细胞浆（胞核）内，P21^WAF1／CIPI蛋白定位于癌细胞核内和支气管粘膜上皮细胞核内，P300／CBP蛋白定位于癌细胞核内和支气管粘膜上皮细胞核内，部分呈核一浆型。参考姚广裕等免疫组化评分标准，每张切片在400倍镜下观察5个视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，共计500个细胞。阳性细胞数≤10％为1分，11％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分；再按染色强度评分：无色为0，淡色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；最后按照乘积分数分为4个等级：“—”（0，1，2），“+”（3，4）“++”（6，8）“+++”（9，12）。TSG101染色结果判定：分数≥3定为阳性，＜3为阴性。P21^WAF1／CIPI免疫组化结果判断标定：≥10％胞核出现棕黄色颗粒为阳性。P300／CBP免疫组化结果判定：≥10％胞核和（或）胞浆出现棕黄色颗粒为阳性。（2）Western Blot检测TSG101在肺癌组织和正常肺组织中的表达。取新鲜样品（1-2克）加5倍裂解液，剪碎、匀浆超声处理，高速低温离心提取上清蛋白，电泳，转印，经封闭后加相应的一抗、二抗及显色试剂检查。结果判定转印膜上出现棕色蛋白条带，并测定蛋白条带的灰度值。4、统计学分析应用SPSS13.0统计软件进行数据处理，采用x²检验分析各组计数资料，采用Spearman等级相关分析TSG101与P300／CBP及P21^WAF1／CIPI表达的关系，采用t检验分析Western Blot图像灰度值，P＜0.05为有非常显著性差异。结果1、TSG101在肺鳞癌、肺腺癌和正常肺组织中的表达。TSG101在肺鳞癌和肺腺癌组织中有表达，主要定位于癌细胞的细胞浆和（或）细胞核。TSG101在正常肺组织强表达。Western Blot结果显示：TSG101在26例肺癌组织和26例正常肺组织中有不同程度的表达，在肺癌组织中的表达明显低于相应的正常肺组织（t=8.578，P=0.000）。2、P21^WAF1／CIPI在肺鳞癌、肺腺癌和正常肺组织中的表达。P21^WAF1／CIPI蛋白定位于肺鳞癌和肺腺癌细胞核内和支气管粘膜上皮细胞核内。3、P300／CBP在肺鳞癌、肺腺癌和正常肺组织中的表达。P300／CBP蛋白定位于肺鳞癌和肺腺癌细胞核内和支气管粘膜上皮细胞核内，部分呈核——浆型。4、TSG101、P21^WAF1／CIPI和P300／CBP蛋白的表达与肺鳞癌和肺腺癌的临床病理学参数的关系。79例肺癌组织中，TSG101表达率为59.49％（47／79），其中同时做Western Blot分析的26例肺癌组织中，TSG101的表达率为46.15％（12／26）。但是TSG101的表达水平与患者的性别（P=0.6412）、年龄（P=0.7887）、肿块大小（P=0.2317）肺癌组织学分型（P=0.0950）和TNM分期（P=0.0670）等肺癌的临床病理学参数无显著相关，然而高-中分化肺癌组织的TSG101表达明显高于低分化肺癌组织（P=0.0256）：有淋巴结转移的组织明显低于无淋巴结转移的组织（P=0.0272）。79例肺癌组织中P21^WAF1／CIPI表达率为60.76％（48／79），而且高-中分化肺癌组织的表达明显高于低分化肺癌组织（P=0.0158）；有淋巴结转移的组织明显低于无淋巴结转移的组织（P=0.0032）。Ⅰ，Ⅱ期表达明显高于Ⅲ，Ⅳ期（P=0.0026）但是P21^WAF1／CIPI的表达水平与患者的性别（P=0.8503）、年龄（P=0.1837）、肿块大小（P=0.9674）肺癌组织学分型（P=0.3071）等肺癌的临床病理学参数无显著相关。79例肺癌组织中P300／CBP表达率为56.96％（45／79），而且高-中分化肺癌组织的表达明显高于低分化肺癌组织（P=0.0187）；有淋巴结转移的组织明显低于无淋巴结转移的组织（P=0.0023）。Ⅰ，Ⅱ期表达明显高于Ⅲ，Ⅳ期（P=0.0069），但是P300／CBP的表达水平与患者的性别（P=0.4375）、年龄（P=0.4956）、肿块大小（P=0.1271）肺癌组织学分型（P=0.7594）等肺癌的临床病理学参数无显著相关。肺癌组织中，TSG101和P300／CBP水平呈正相关（r=0.689，p=0.000），TSG101和P21^WAF1／CIPI水平呈正相关（r=0.710，p=0.000）P300／CBP和P21^WAF1／CIPI水平呈正相关（r=0.461，p=0.000）。讨论TSG101在肿瘤发生中的作用目前尚有争议。人TSG101基因所在的染色体11p15.1-2区，正是已知的人类多种恶性肿瘤如乳腺癌、wilm’s瘤及肺癌等发生等位基因杂合丢失的区带，而该区带被认为包含有肿瘤抑制基因。但steiner等人则提出了相反的看法。Oh等报道表明TSG101和P21^WAF1／CIPI抑制分化的能力是通过特殊基因的表达来调节的。实际上P21^WAF1／CIPI和TSG101与共同激活因子P300／CBP在转录调控中相互作用，他们是复合物的一部分，共同参与抑制肿瘤细胞分化。我们实验的免疫组化结果显示TSG101在肺鳞癌和肺腺癌组织中有表达，其胞浆（或胞核）表达率可达59.49％，而且TSG101在肺癌组织中的表达水平明显低于其在正常肺组织中的表达水平，Western Blot结果也进一步证实了这个结论。TSG101的表达水平与患者的性别、年龄、肿块大小、肺癌组织学分型和TNM分期等肺癌的临床病理学参数无显著相关，然而高-中分化肺癌组织的TSG101表达明显高于低分化肺癌组织；有淋巴结转移的组织明显低于无淋巴结转移的组织。Yun oh等人报道TSG101在肺癌中没有发生突变，野生型的转录片断只发生于正常肺组织中和部分非小细胞肺癌中，在一部分非小细胞肺癌中和小细胞肺癌中存在一定数量的剪接异构体，Lo等研究结果表明短剪接体的表达在癌组织中比正常组织及血细胞中多，TSG101基因在肿瘤发生中并没有发生改变，而是其转录子的剪接出现了异常，全长转录子减少，使其表达减少。我们的研究结果提示：TSG101在肺癌中的低表达可能与肺癌中存在较正常癌旁肺组织更多的剪接异构体所致，所以TSG101蛋白在正常肺组织中高表达，在肺癌中低表达，并且TSG101的表达随着肿瘤级别的增高而降低。Feng等研究报道TSG101蛋白在体外培养的鼠和人体细胞中维持在一个很小的范围，超出该范围即可发生细胞的异常生长，我们的研究TSG101在肺癌组织中的低表达，提示TSG101在肺癌中的蛋白表达可能是由剂量依赖性所致，我们推测由于TSG101表达的蛋白量减少，其抑制肿瘤细胞生长的能力减弱，导致肺癌的发生。对TSG101异常剪接体与肿瘤分期关系的研究表明：肿瘤进展与TSG101异常剪接体水平增高密切相关。我们研究结果TSG101蛋白表达与临床TNM分期无显著差异（P＞0.05），这可能与我们实验的样本量不足有关，待扩大样本量进一步证实。P21^WAF1／CIPI蛋白在肺癌组织中的阳性表达率为（48／79）60.76％，P21^WAF1／CIPI蛋白的表达与肺鳞癌和肺腺癌肿瘤细胞分化有关，本研究发现它在分化好的癌组织中呈高表达，在低分化癌组织中呈低表达，P21^WAF1／CIPI蛋白阳性表达患者发生淋巴结转移的几率明显低于阴性表达者，这与Akitak的报道一致。本研究结果显示在48例P21^WAF1／CIPI表达的肺癌组织中有42例出现了TSG101的表达，两者呈正相关（r=0.710）。与Hyesun oh等报道TSG101能够正性调控P21^WAF1／CIPI的结论一致。本研究提示：TSG101结合cyclin依赖激酶CDK抑制剂P21^WAF1／CIP，TSG101是P21^WAF1／CIPI蛋白稳定性的关键调控因子，P21^WAF1／CIP作为细胞周期抑制剂作用于CyclinE／cdk2复合物，暗示TSG101蛋白作为细胞周期抑制剂和潜在的肿瘤抑制因子的功能，二者在抑制肺癌的发生过程中具有协同作用。P300／CBP在肺癌组织中的表达为56.96％（45／79），P300／CBP的表达随着肿瘤级别的增高而降低的趋势，有淋巴结转移的组织明显低于无淋巴结转移的组织，TNM分期中，Ⅰ、Ⅱ期的表达明显高于Ⅲ、Ⅳ期。本研究结果显示45例P300／CBP表达的肺癌组织中有40例出现了TSG101的表达，两者呈正相关（r=0.689）。我们推测：TSG101与P300／CBP相互作用，TSG101的碳末端结合P300／CBP的区域抑制转录，而且只有具有螺旋卷曲区域的TSG101蛋白才能作为转录抑制因子参与甾类受体激素转录活性的调控，达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。总之，肿瘤的形成与发展是一个多基因、多步骤、多阶段的病理过程，需要多种抑癌基因的参与。TSG101在肺癌组织中低表达，而且其表达水平与P300／CBP及P21^WAF1／CIPI的表达呈正相关，TSG101基因及其在多种人类肿瘤及正常组织中发生的异常剪接在人类肿瘤发生中的作用仍备受关注，该基因作为新的抑癌候选者，其剪接变异体在肿瘤发生发展过程中的变化规律及其作用的阐释必将为人类肿瘤的发生机制及早期筛查提供重要线索，为肿瘤的防治工作带来新的契机。结论1、TSG101在肺癌中的表达显著低于正常肺组织，在肺鳞癌，腺癌组织中，随分化水平的降低表达水平下调。2、TSG101、P21^WAF1／CIPI和P300／CBP关系密切，即TSG101和P21^WAF1／CIPI，TSG101和P300／CBP的表达水平呈正相关。3、TSG101、P21^WAF1／CIPI及P300／CBP与肺癌分化程度、淋巴结转移差异有意义，P21^WAF1／CIP和P300／CBP与TNM分期差异有意义。