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胸膜肺炎放线杆菌(Actinocillus pleuropneumoniae,APP)是猪传染性胸膜肺炎的病原菌。该病以纤维性肺炎和出血性肺炎为主要病症,具有高发病率和死亡率,呈世界性流行,给全球养猪业造成严重的经济损失,对杂交野猪的饲养造成潜在威胁。严谨应答是细菌在应对环境压力和营养不足时,为生存快速感知和适应环境变化的调控反应。(p)ppGpp是细菌严谨反应的重要信号分子,主要由relA基因编码的合成酶RelA磷酸化GDP或GTP而合成。因此,本研究通过同源重组、卡那抗性及蔗糖负向筛选的方法,以本实验室保存的APP血清7型野生菌S8为亲本株,构建relA基因缺失株S8△relA,并对其生物学特性进行了初步研究,为进一步探究APP的适应性和致病机制奠定了一定的基础。本研究的主要内容包括:构建缺失株S8△relA:根据GenBank中APP血清7型S8株relA基因序列(NC.009053.1)和pET28a质粒设计引物,分别扩增relA基因同源上下臂relAS、relAX及kan基因,再通过融合PCR将三个片段连接,并克隆至pEMOC2载体中,构建重组转移质粒pEMOC2-relAS-kan-relAX。重组质粒电转至E.coliβ2155获得的重组菌E.coli(pEMOC2-relAS-kan-relAX)作为供体菌,亲本株S8作为受体菌,通过接合转移的方法,筛选出具有卡那抗性(Kan R)和氯霉素抗性(CmR)的单交换菌株。利用引物P7/P8鉴定正确后,挑取单菌落分别影印于含Cm抗性平板和含10%蔗糖、Kan抗性平板上,筛选出具有蔗糖抗性、KanR和氯霉素敏感(CmS)的克隆,再利用P3/P4和P9/P10引物进行PCR鉴定,能够扩增出kan基因(816bp)片段,不能扩增出relA基因片段,即可确定该克隆为缺失株。缺失株S8△relA生物学特性:将得到的缺失株S8△relA在体外连续传代培养,通过引物鉴定,结果表明该缺失株具有良好的遗传稳定性;生长曲线测定结果表明缺失株S8△relA与亲本株S8增殖速度变化差异不显著。在平台期营养限制环境下,24 h后S8△relA存活能力降低,说明缺失株的适应性下降。对20种不同氨基酸分别进行缺失,其中在Gly、Ile、Val营养缺失时,S8△rel增殖能力显著受到抑制,结果表明(p)ppGpp能够感知Gly、Ile、Val这三种氨基酸形成的外界压力信号。持留菌形成试验:100μg/mL氟苯尼考杀菌处理3 h后,与野生菌S8相比,缺失株S8△relA形成具有耐药表型的活菌比例显著下降,说明(p)ppGpp影响APP持留菌的形成。缺失株S8△relA生物被膜形成能力随培养时间延长,逐渐降低,并且36 h时生物被膜密度仅为野生菌S8的0.5倍;另外,体外抗肺泡巨噬细胞(PAM)吞噬能力也显著减低,试验结果显示与野生菌S8相比差异极显著。对小鼠致病性实验结果表明,基因缺失株S8△relA相比亲本株S8毒力降低2.7倍。以上结果表明(p)ppGpp在环境胁迫下参与APP适应性调控,并对其毒力有一定的影响。