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目的:肝癌是危害人类健康的重大疾病,世界上有超过50%的肝癌病例发生在我国,临床使用的的抗肝癌药物存在不良反应严重、容易产生耐药等问题,亟待发展新型的抗肝癌药物。原阿片碱是一种从延胡索中提取分离得到的异喹啉类生物碱,分子量为353.37Da,近年来其抗肿瘤活性引起了广泛的关注,但其对肝细胞癌的作用及分子机制还不清楚。本研究拟阐明原阿片碱抑制肝细胞癌生长的分子机制,为发展原阿片碱为新型的抗肝癌药物提供依据。
方法:通过CCK-8技术测定原阿片碱对肿瘤细胞生长的影响;细胞凋亡采用Hoechst33342/PI双染及流式细胞技术分析;采用JC-1染色研究原阿片碱与肝癌细胞线粒体膜电位的关系;利用蛋白质印迹技术分析线粒体凋亡途径相关蛋白表达水平。通过人肝癌裸鼠移植性肿瘤模型确定原阿片碱的体内抗肿瘤活性;HE染色观察了原阿片碱对肿瘤组织的影响;TUNEL分析确定肿瘤组织的凋亡率;免疫组织化学检测原阿片碱对肿瘤组织中Bcl-2和Ki67的表达量的影响。
结果:CCK-8法检测结果显示,原阿片碱对多种肿瘤细胞呈现抗肿瘤活性,对人肝癌细胞BEL-7402和HepG2的抑制作用最为显著,IC50分别为26.32±9.13μM和32.91±8.49μM。Hoechst33342/PI双染分析结果表明,肝癌细胞经7.5、15.0和30.0μM的原阿片碱处理48h后,肝癌细胞呈现核皱缩、破碎、凋亡小体等凋亡现象。Annexin-V/PI双染法对肝癌细胞凋亡作用的定量分析表明,7.5、15.0和30.0μM原阿片碱对人肝癌细胞BEL-7402的凋亡率分别为23.51%±4.65%、44.58%±4.48%和55.16%±7.23%,而对HepG2细胞的凋亡率分别为15.60%±6.45%、26.94%±3.49%和40.51%±10.11%。JC-1染色法对细胞线粒体膜电位影响的定量分析结果表明,7.5、15.0和30.0μM原阿片碱可以降低肝癌细胞的线粒体膜电位,对人肝癌细胞BEL-7402的绿色荧光比率分别为33.85%±8.34%、48.54%±8.38%和57.99%±5.67%,而对HepG2细胞的绿色荧光比率分别为26.26%±10.82%、43.91%±20.29%和56.79%±9.19%。蛋白质印迹分析表明,原阿片碱处理可以显著上调细胞色素C、Apaf-1、Bax,cleaved-PARP、cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9的蛋白水平,抑制癌基因Bcl-2表达,并表现出浓度依赖性。体内实验证实,原阿片碱可以显著抑制人肝癌细胞裸鼠移植性肿瘤的生长,12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg体重腹腔注射给药,对人肝癌细胞HepG2移植瘤的肿瘤抑制率分别为23.19%±10.32%、46.38%±8.47%和72.46%±7.14%;HE染色和TUNEL结果表明原阿片碱能显著促进肿瘤组织细胞的凋亡,12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg原阿片碱给药,凋亡率分别为17.84%±3.55%、49.63%±8.73%、71.88%±2.53%;免疫组化结果显示原阿片碱能够下调肿瘤组织中Bcl-2和Ki67的表达水平,12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg原阿片碱给药,Bcl-2阳性细胞数量分别为54.16%±2.37%、39.93%±3.88%和21.82%±3.51%;12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg原阿片碱给药,Ki67阳性细胞数量从78.19%±2.73%,分别降低至67.74%±2.37%、48.01%±2.49%和24.10%±4.37%。
结论:我们的研究显示原阿片碱可以通过线粒体途径诱导人肝癌细胞BEL-7402和HepG2凋亡。此外,原阿片碱显著抑制人肝癌细胞HepG2裸鼠异体移植瘤的生长,该化合物有希望被开发为治疗肝细胞癌的新型抗癌药物。
方法:通过CCK-8技术测定原阿片碱对肿瘤细胞生长的影响;细胞凋亡采用Hoechst33342/PI双染及流式细胞技术分析;采用JC-1染色研究原阿片碱与肝癌细胞线粒体膜电位的关系;利用蛋白质印迹技术分析线粒体凋亡途径相关蛋白表达水平。通过人肝癌裸鼠移植性肿瘤模型确定原阿片碱的体内抗肿瘤活性;HE染色观察了原阿片碱对肿瘤组织的影响;TUNEL分析确定肿瘤组织的凋亡率;免疫组织化学检测原阿片碱对肿瘤组织中Bcl-2和Ki67的表达量的影响。
结果:CCK-8法检测结果显示,原阿片碱对多种肿瘤细胞呈现抗肿瘤活性,对人肝癌细胞BEL-7402和HepG2的抑制作用最为显著,IC50分别为26.32±9.13μM和32.91±8.49μM。Hoechst33342/PI双染分析结果表明,肝癌细胞经7.5、15.0和30.0μM的原阿片碱处理48h后,肝癌细胞呈现核皱缩、破碎、凋亡小体等凋亡现象。Annexin-V/PI双染法对肝癌细胞凋亡作用的定量分析表明,7.5、15.0和30.0μM原阿片碱对人肝癌细胞BEL-7402的凋亡率分别为23.51%±4.65%、44.58%±4.48%和55.16%±7.23%,而对HepG2细胞的凋亡率分别为15.60%±6.45%、26.94%±3.49%和40.51%±10.11%。JC-1染色法对细胞线粒体膜电位影响的定量分析结果表明,7.5、15.0和30.0μM原阿片碱可以降低肝癌细胞的线粒体膜电位,对人肝癌细胞BEL-7402的绿色荧光比率分别为33.85%±8.34%、48.54%±8.38%和57.99%±5.67%,而对HepG2细胞的绿色荧光比率分别为26.26%±10.82%、43.91%±20.29%和56.79%±9.19%。蛋白质印迹分析表明,原阿片碱处理可以显著上调细胞色素C、Apaf-1、Bax,cleaved-PARP、cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-9的蛋白水平,抑制癌基因Bcl-2表达,并表现出浓度依赖性。体内实验证实,原阿片碱可以显著抑制人肝癌细胞裸鼠移植性肿瘤的生长,12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg体重腹腔注射给药,对人肝癌细胞HepG2移植瘤的肿瘤抑制率分别为23.19%±10.32%、46.38%±8.47%和72.46%±7.14%;HE染色和TUNEL结果表明原阿片碱能显著促进肿瘤组织细胞的凋亡,12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg原阿片碱给药,凋亡率分别为17.84%±3.55%、49.63%±8.73%、71.88%±2.53%;免疫组化结果显示原阿片碱能够下调肿瘤组织中Bcl-2和Ki67的表达水平,12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg原阿片碱给药,Bcl-2阳性细胞数量分别为54.16%±2.37%、39.93%±3.88%和21.82%±3.51%;12.5mg/kg、25mg/kg和50mg/kg原阿片碱给药,Ki67阳性细胞数量从78.19%±2.73%,分别降低至67.74%±2.37%、48.01%±2.49%和24.10%±4.37%。
结论:我们的研究显示原阿片碱可以通过线粒体途径诱导人肝癌细胞BEL-7402和HepG2凋亡。此外,原阿片碱显著抑制人肝癌细胞HepG2裸鼠异体移植瘤的生长,该化合物有希望被开发为治疗肝细胞癌的新型抗癌药物。