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Dok(downstream of tyrosine kinase/Docking protein)是酪氨酸激酶下游蛋白,在细胞信号转导中至关重要。该家族包含了 Dok1至Dok7共7个成员,它们具有相似的结构特征:N端PH结构域、中央PTB结构域以及C末端区域。PH结构域可以帮助某些蛋白定位于质膜上,中央PTB结构域主要结合磷酸化的酪氨酸,C末端可以结合信号分子调节下游信号通路。Dok5是Dok家族成员之一,已有研究报道,Dok5 可以结合 c-Ret(proto-oncogene encodes receptor tyrosine kinase,Ret)受体,通过 GDNF(Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor,GDNF)信号通路促进神经细胞分化;同时也是受体酪氨酸激酶中的原肌球蛋白相关激酶(tropomyosin-related kinase,Trk)受体的底物,能通过PTB结构域的酪氨酸磷酸化与 TrkB/C 结合,并激活 MAPK(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路,参与神经细胞的分化和凋亡;并且可以被胰岛素受体磷酸化,参与胰岛素信号通路。这些信号通路均在神经系统的发育中发挥重要功能,因此,推测Dok5是一个神经发育相关蛋白。但目前关于Dok5在机体内的功能和分子机制研究未见报道。首先,我们对Dok5基因的序列和编码的氨基酸序列进行了分析。Dok5长度为921 bp,含8个外显子和7个内含子。编码306个氨基酸,包含PH结构域、PTB结构域和C末端区域。其相对分子质量为35.453 kDa,理论pI为9.0,其氨基酸序列在不同物种中高度保守。SignalP信号肽和TM跨膜域预测结果显示Dok5既没有信号肽结构,也没有跨膜区。通过ProtParam和Protscale在线分析显示,Dok5的不稳定系数为42.69,总平均亲水性系数为-0.519,尽管C端富含疏水区,但整体上仍是一个稳定的亲水性蛋白。NetPhos3.1 Server在线预测显示,Dok5含有50个潜在的磷酸化位点,其中包含33个丝氨酸磷酸化位点,14个苏氨酸磷酸化位点,3个酪氨酸磷酸化位点。作为一个信号蛋白,Dok5的众多磷酸化位点很可能作为信号分子的停泊位点,激活下游信号通路。这些基本信息为后续的蛋白表达提供指导意义。一方面,为了寻找Dok5的相互作用蛋白以揭示其在信号转导过程中的分子机制,我们在原核表达系统进行了 Dok5不同结构域蛋白的表达。分析了用PCR方法分别扩增编码Dok5全长(FL)、PTB/PH/C结构域的cDNA,并将其克隆入表达载体pGEX 6p-1中,获得了原核表达质粒pGEX 6p-1-Dok5 FL、pGEX 6p-1-Dok5 PH、pGEX 6p-1-Dok5 PTB、pGEX 6p-1-Dok5 C。将重组质粒转化大肠杆菌BL21,筛选高效表达GST融合蛋白的菌株。在0.1mM IPTG、16℃条件下,在大肠杆菌BL21中获得Dok5 FL、Dok5 PH、Dok5 PTB蛋白的表达,并进行了Glutathion Sepharose 4B亲和层析柱纯化。用Dok5特异性抗体进行Western blot检测,结果表明所表达纯化的融合蛋白与Dok5抗体具有良好的反应性,为后续通过GST pull down寻找Dok5相互作用蛋白奠定了实验基础。另一方面,原核表达蛋白缺少翻译后修饰,不能得到正确折叠的活性蛋白。为了进行Dok5在体水平的功能研究,获得能特异性识别Dok5的抗体至关重要。目前规模化生产的抗体均是用C末端的部分合成多肽免疫动物所得的多克隆抗体,能够识别原核表达的蛋白,但在哺乳动物细胞和动物组织中没有良好的特异性。而昆虫表达系统由于具有翻译后修饰功能,所获得的蛋白更接近于天然蛋白,以此为抗原制备的抗体能够特异识别天然蛋白。因此,我们在昆虫细胞表达系统中进行了 Dok5 FL和C端蛋白的表达,以作为抗原在后续工作中进行抗体的制备。将Dok5 FL和C端分别克隆到pFastBac1载体上,构建了 pFastBac1-Dok5 FL、pFastBac1-Dok5 C质粒。将重组质粒转化DH10感受态细胞,通过蓝白斑筛选得到高效产Bacmid的菌株,用Bacmid转染昆虫细胞SF21,分别获得P1/P2/P3病毒;用P3病毒感染High Five细胞,以期获得大量胞内表达的目的蛋白。同时,由于Dok5没有信号肽结构,我们在pFastBac1载体上引入了 Hemolin信号肽,构建了pFastBac1-Hemolin-Dok5 FL、pFastBac1-Hemolin-Dok5 C质粒,以尝试使蛋白能够分泌表达,提高蛋白表达纯化的效率,从而为制备Dok5特异性抗体提供活性蛋白抗原。