在世界范围内,急性胰腺炎是常见的急腹症,其年发病率约为13-45/100000。而重症急性胰腺炎有较高的死亡率和并发症的发生率,一直是临床上治疗的难点。根据SAP病人的死亡高峰可将病程分为两个阶段:急性期(通常为发病的一周之内)及发病一周之后的感染期。发病早期由于胰酶的活化、炎症介质细胞因子和氧自由基的产生以及机体高凝状态引发的机体超强炎症反应,即系统性炎症反应综合征(SIRS)进一步导致的全身器官功能衰竭,随着脏器支持水平和微创技术的提高这一阶段病人病死率较前明显下降;在疾病发展的后期,胰腺坏死组织及胰周积液的感染引起感染相关并发症是目前导致SAP病人死亡的主要原因,而肠道内菌群失调,肠黏膜屏障功能障碍和肠源性细菌易位被认为是导致胰腺坏死组织及胰周积液感染的主要原因。脊椎动物体内寄居者庞大的微生物群,包括细菌、病毒和真菌,尤其是空腔脏器,如口腔和小肠。肠道是体内最复杂和数量最多的微生态。包括300-500菌种和1014个细菌,其中的大多数是不能常规培养出来的。在健康的个体中,革兰氏阴性变形菌和拟杆菌,和革兰氏阳性厚壁菌门,如梭菌属和乳酸杆菌,是肠道细菌中主要门类,而产甲烷菌是主要的肠道古细菌早期关于肠道菌群的研究对集中与炎症性疾病。近些年的研究发现肠道菌群在维护正常的肠道微生态,调节宿主的免疫和影响包括器官发育及代谢在内的宿主发育及生理都起及其重要的作用。肠道菌群对正常健康人体的生长发育和免疫调节中起重要作用,而在疾病时肠道菌群紊乱常会易位入血,加重病情。调节紊乱的肠道菌群,预防肠源性细菌易位一直是临床上治疗重症病人的重点和难点。如何早期快速诊断肠源性细菌易位对预防和治疗重症急性胰腺炎后期胰腺坏死感染具有重要意义。细菌的DNA相对稳定,本课题主要采用基于细菌DNA的PCR-DGGE技术研究重症急性胰腺炎是肠道菌群和肠黏膜上皮随发病时间的变化规律,同时研究DGGE在重症急性胰腺炎时肠源性细菌易位的早期诊断的价值。本文共分四部分:第一部分 重症急性胰腺炎动物模型的建立与验证目的:为研究肠道菌群和肠源性细菌易位的关系建立经十二指肠的逆行性胰胆管注射牛磺胆酸钠的重症急性胰腺炎大鼠模型。方法:24只SD大鼠被随机分为对照组(n=6只)和胰腺炎组(n=18组)。造模成功后的2小时,6小时及12小时取材,胰腺组织行病理检查,同时评价造模后的肝肾功能及该胰腺炎模型的死亡率情况。结果:对照组的12h的生存率100%(6/6),而胰腺炎组,造模成功后生存率29%(7/24)。胰腺炎组的大鼠的血淀粉酶、脂肪酶的水平明显高于对照组。包括谷丙转氨酶和谷草转氨酶的肝功能随造模时间的明显升高,而肌酐、尿素氮和胱抑素C等肾功能未见显著变化。结论:逆行性胰胆管注射牛磺胆酸钠造胰腺炎模型稳定,死亡率较高,能致严重的胰腺损伤,可以作为研究重症急性胰腺炎的动物模型。第二部分 重症急性胰腺炎小肠菌群及肠黏膜屏障变化目的:重症急性胰腺炎时胰腺坏死组织感染是决定病情预后的重要因素之一。本部分主要研究重症急性胰腺炎模型大鼠随造模时间不同小肠肠道菌群及肠黏膜上皮变化特征。方法:24只大鼠随机分为4组(每组6只)。一组为正常对照组,其他三组为行逆行性胰胆管注射牛磺胆酸钠,模型建立后2h,6h及12h后处死大鼠。采用变形梯度凝胶电泳研究造模不同时间小肠菌群的变化特征。采用透射电镜及普通病理检测肠黏膜形态学及紧密连接结构变化,应用免疫组化法研究紧密连接蛋白Z0-1的变化情况。结果:对各组结肠粪便菌群DGGE分析显示,重症急性胰腺炎模型建立后不同时间点回肠菌群组成不同。2h即出现变化,6小时达到最大,随着再造模时间继续延长,菌群结构与正常组的差异逐渐减少。具体的菌群变化特征为以大肠杆菌等有害菌的明显增多,乳酸杆菌等有益菌的明显减少。造模后肠粘膜屏障功能较正常对照明显受损。小肠绒毛的完整性受到破坏,紧密连接的缝隙较正常对照组明显增宽。结论:大鼠重症急性胰腺炎模型建立以后,小肠肠道菌群内随造模时间明显发生紊乱,肠粘膜屏障功能受损。第三部分重症急性胰腺炎时结肠肠道菌群及肠黏膜变化目的:重症急性胰腺炎时肠源性细菌易位被认为是导致胰腺坏死组织及胰周积液感染的主要原因,其具体机制尚未清楚。而肠道菌群失调及肠屏障功能受损是导致肠源性细菌易位的主要因素,本研究主要探讨重症急性胰腺炎大鼠结肠肠道菌群及结肠上皮屏障功能变化。方法:逆行性胰胆管注射牛磺胆酸钠建立重症急性胰腺炎大鼠模型。采用变形梯度凝胶电泳(DGGE)方法检测对照组及重症急性胰腺炎造模后2,6和12小时结肠大便的菌群变化情况。同时取大鼠盲肠肠壁行病理,透射电镜及免疫组化检测观察造模后不同时间的肠上皮屏障功能变化。结果:重症急性胰腺炎模型建立后粪便DGGE结果显示建模早期即出现结肠肠道菌群不同时间点结肠菌群组成不同,其中6h和正常组差异最大,随着造模时间继续延长,菌群结构与正常组的差异逐渐减少,造模后12小时向正常菌群结构变化。表现为有益菌的减少,致病菌的增多。结肠上皮免疫组化显示紧密连接蛋白ZO-1随造模时间的延长表达明显减少,电镜显示结肠上皮的紧密连接间隙随造模时间的延长明显增宽。结论:重症急性胰腺炎会导致结肠肠道菌群的紊乱。同时重症急性胰腺炎时结肠粘膜上皮的紧密连接受损间隙增大。二者共同导致重症急性胰腺炎时肠源性细菌易位的发生。第四部分重症急性胰腺炎时肠源性细菌易位的检测目的:早期精确诊断细菌易位对预防和治疗重症急性胰腺炎后期的细菌感染有重要意义。本研究主要采用变形梯度凝胶电泳方法来早期诊断重症急性胰腺炎大鼠模型的肠源性细菌易位。方法:24只大鼠随机分为4组,每组6只。一组为正常组。其余3组为重症急性胰腺炎组。收集正常对照组和胰腺炎组于造模后2h,6h和12h的腹水及血行PCR-DGGE检测其中细菌量和传统培养相对比。结果:胰腺炎大鼠模型造模成功后2小时腹水中细菌的阳性率为66%。重症急性胰腺炎时肠源性细菌易位的主要细菌为梭杆菌属,大肠杆菌,乳酸杆菌和肺炎克雷伯菌等肠道细菌。造模2h后的传统培养的细菌阳性率远远低于PCR-DGGE的阳性率(29%vs 66%,p<0.05)。在造模后第6h和第12h传统细菌培养的阳性率仍显著低于DGGE检测结果。胰腺炎大鼠模型血中在造模后2小时即出现DGGE阳性,在造模后2h,6h和12h的DGGE阳性率均显著高于传统培养组.结论:与传统培养结果不同,PCR-DGGE能够早期检测重症急性胰腺炎的肠源性细菌易位。基于DNA的分子技术能够检测出常规培养不能检测出的失活细菌。全文结论:逆行性胰胆管注射牛磺胆酸钠造胰腺炎模型稳定,死亡率较高,能致严重的胰腺损伤,可以作为研究重症急性胰腺炎的动物模型。大鼠重症急性胰腺炎模型建立以后,小肠肠道菌群内随造模时间明显发生紊乱,肠粘膜屏障功能受损。重症急性胰腺炎会导致结肠肠道菌群的紊乱。同时重症急性胰腺炎时结肠粘膜上皮的紧密连接受损间隙增大。二者共同导致重症急性胰腺炎时肠源性细菌易位的发生。重症急性胰腺炎时肠道菌群紊乱及肠黏膜上皮的受损共同导致肠源性细菌易位的发生。变形梯度凝胶电泳是能够早期诊断重症急性胰腺炎肠源性细菌易位的发生。