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研究背景和目的：
宫腔粘连(Intrauterine adhesions，IUA)是严重危害女性生殖健康的疾病之一，其病理基础是子宫内膜基底层损伤后修复障碍，子宫内膜上皮被纤维组织替代，最终发生纤维化导致粘连形成。胶原过度沉积是IUA纤维化发生的关键，但关于胶原合成的调控机制目前尚不明确。前期研究通过lUA患者子宫内膜组织进行全基因测序发现Foxf2、Smad6与COL5A2异常表达，且通过启动子分析发现COL5A2上游启动子区域可能存在Foxf2与Smad6的转录结合位点。Foxf2是叉头框转录因子家族的成员之一，在间质中特异表达，参与胶原的合成。而Smad6是TGF-β/骨成型蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信号通路的关键负调控分子，可以抑制胶原的合成。本研究推测Foxf2与Smad6可能共调控COL5A2转录表达参与IUA的发病，目前尚无关于这方面的研究报道。
本研究拟通过体内外实验验证Foxf2和Smad6参与纤维化，并通过免疫共沉淀(CoIP)、染色体免疫共沉淀(ChIP)、荧光素酶报告基因实验验证Foxf2与Smad6共调控COL5A2的转录表达，阐明其在IUA纤维化中的发病机制，为IUA的防治提供理论依据。
方法与结果：
1.下调Foxf2或上调Smad6表达对TGF-β1诱导的人子宫内膜间质细胞株(THESCs)纤维化的影响
方法：通过TGF-β1刺激THESCs构建子宫内膜细胞纤维化模型;分别于TGF-β1建模前和建模后转染si-Foxf2或pc-DNA3.1-Smad6验证下调foxf2或上调Smad6表达对TGF-β1诱导的细胞纤维化的影响。qRT-PCR及WB法检测纤维化标记物COL5A2、COL1A1、FN、a-SMA表达;EdU检测细胞增殖能力;流式检测细胞周期。
结果：TGF-β1促进THESCs纤维化，纤维化标记物COL1A1、COL5A2、FN、a-SMA等表达明显增加：以及促进细胞增殖和细胞周期由G0/G1期进入S期;下调Foxf2或上调Smad6表达均可抑制TGF-β1诱导的纤维化改变，抑制细胞的增殖，阻滞细胞周期由G0/G1期向S期进入;其中同时下调Foxf2和上调Smad6表达效果更明显。
2.Foxf2与Smad6共调控COL5A2的转录表达
方法：通过细胞免疫荧光检测Foxf2与Smad6在细胞的定位以及与COL5A2的关系;CoIP检测Foxf2与Smad6的相互作用，ChiP、荧光素酶基因报告实验检测Foxf2和Smad6与COL5A2启动子IX域的结合;最后通过LV-Foxf2和pcDNA-Smad6共转染THESCs，qRT-PCR检测COL5A2表达验证两者调控COL5A2转录表达的关系。
结果：细胞免疫荧光结果显示Foxf2与Smad6聚集于核内，Foxf2正调控COL5A2表达，Smad6负调控COL5A2表达;CoIP结果显示Foxf2与Smad6蛋白间相互结合;ChiP和荧光素酶报告基因结果显示COL5A2上游启动子区域存在Foxf2和Smad6共同的转录结合位点;qRT-PCR结果是Smad6可抑制Foxf2诱导的COL5A2转录，但不能完全逆转。
3.Foxf2与Smad6在大鼠IUA发病中的作用及其妊娠的影响
方法：采用机械搔刮和感染双重损伤法构建大鼠IUA模型，在造模时子宫壁局部注射腺病毒ADV2-Foxf2-1810和ADV4-Smad6分别下调FoXf2和上调Smad6表达。通过HE染色检测内膜腺体数量，Masson染色检测内膜纤维化面积，免疫组化检测纤维化指标COL5A2、COL1A1、Foxf2、Smad6和整合素αvβ3表达，扫描电镜检测子宫内膜上皮细胞饮突表达，与雄鼠交配检测胚胎数量。
结果：下调Foxf2或上调Smad6表达均可减轻双重损伤法导致的大鼠IUA，减轻纤维化，改善子宫内膜腺体表达，抑制COL5A2及COL1A1的表达：增加αvβ3和胞饮突的表达，改善子宫内膜容受性，提高妊娠胚胎数量。
研究结论：Foxf2和Smad6均参与了THESCs纤维化过程，两者相互结合，在COL5A2启动子区域具有相同的转录结合位点。在大鼠IUA发病过程中，Foxf2与Smad6可能通过共调控COL5A2的转录表达参与了IUA的发病，下调Foxf2或上调Smad6表达均可抑制纤维化，提高子宫内膜容受性，改善妊娠结局。
宫腔粘连(Intrauterine adhesions，IUA)是严重危害女性生殖健康的疾病之一，其病理基础是子宫内膜基底层损伤后修复障碍，子宫内膜上皮被纤维组织替代，最终发生纤维化导致粘连形成。胶原过度沉积是IUA纤维化发生的关键，但关于胶原合成的调控机制目前尚不明确。前期研究通过lUA患者子宫内膜组织进行全基因测序发现Foxf2、Smad6与COL5A2异常表达，且通过启动子分析发现COL5A2上游启动子区域可能存在Foxf2与Smad6的转录结合位点。Foxf2是叉头框转录因子家族的成员之一，在间质中特异表达，参与胶原的合成。而Smad6是TGF-β/骨成型蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信号通路的关键负调控分子，可以抑制胶原的合成。本研究推测Foxf2与Smad6可能共调控COL5A2转录表达参与IUA的发病，目前尚无关于这方面的研究报道。
本研究拟通过体内外实验验证Foxf2和Smad6参与纤维化，并通过免疫共沉淀(CoIP)、染色体免疫共沉淀(ChIP)、荧光素酶报告基因实验验证Foxf2与Smad6共调控COL5A2的转录表达，阐明其在IUA纤维化中的发病机制，为IUA的防治提供理论依据。
方法与结果：
1.下调Foxf2或上调Smad6表达对TGF-β1诱导的人子宫内膜间质细胞株(THESCs)纤维化的影响
方法：通过TGF-β1刺激THESCs构建子宫内膜细胞纤维化模型;分别于TGF-β1建模前和建模后转染si-Foxf2或pc-DNA3.1-Smad6验证下调foxf2或上调Smad6表达对TGF-β1诱导的细胞纤维化的影响。qRT-PCR及WB法检测纤维化标记物COL5A2、COL1A1、FN、a-SMA表达;EdU检测细胞增殖能力;流式检测细胞周期。
结果：TGF-β1促进THESCs纤维化，纤维化标记物COL1A1、COL5A2、FN、a-SMA等表达明显增加：以及促进细胞增殖和细胞周期由G0/G1期进入S期;下调Foxf2或上调Smad6表达均可抑制TGF-β1诱导的纤维化改变，抑制细胞的增殖，阻滞细胞周期由G0/G1期向S期进入;其中同时下调Foxf2和上调Smad6表达效果更明显。
2.Foxf2与Smad6共调控COL5A2的转录表达
方法：通过细胞免疫荧光检测Foxf2与Smad6在细胞的定位以及与COL5A2的关系;CoIP检测Foxf2与Smad6的相互作用，ChiP、荧光素酶基因报告实验检测Foxf2和Smad6与COL5A2启动子IX域的结合;最后通过LV-Foxf2和pcDNA-Smad6共转染THESCs，qRT-PCR检测COL5A2表达验证两者调控COL5A2转录表达的关系。
结果：细胞免疫荧光结果显示Foxf2与Smad6聚集于核内，Foxf2正调控COL5A2表达，Smad6负调控COL5A2表达;CoIP结果显示Foxf2与Smad6蛋白间相互结合;ChiP和荧光素酶报告基因结果显示COL5A2上游启动子区域存在Foxf2和Smad6共同的转录结合位点;qRT-PCR结果是Smad6可抑制Foxf2诱导的COL5A2转录，但不能完全逆转。
3.Foxf2与Smad6在大鼠IUA发病中的作用及其妊娠的影响
方法：采用机械搔刮和感染双重损伤法构建大鼠IUA模型，在造模时子宫壁局部注射腺病毒ADV2-Foxf2-1810和ADV4-Smad6分别下调FoXf2和上调Smad6表达。通过HE染色检测内膜腺体数量，Masson染色检测内膜纤维化面积，免疫组化检测纤维化指标COL5A2、COL1A1、Foxf2、Smad6和整合素αvβ3表达，扫描电镜检测子宫内膜上皮细胞饮突表达，与雄鼠交配检测胚胎数量。
结果：下调Foxf2或上调Smad6表达均可减轻双重损伤法导致的大鼠IUA，减轻纤维化，改善子宫内膜腺体表达，抑制COL5A2及COL1A1的表达：增加αvβ3和胞饮突的表达，改善子宫内膜容受性，提高妊娠胚胎数量。
研究结论：Foxf2和Smad6均参与了THESCs纤维化过程，两者相互结合，在COL5A2启动子区域具有相同的转录结合位点。在大鼠IUA发病过程中，Foxf2与Smad6可能通过共调控COL5A2的转录表达参与了IUA的发病，下调Foxf2或上调Smad6表达均可抑制纤维化，提高子宫内膜容受性，改善妊娠结局。