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中药历史悠久、疗效确切,是现代药物研发的重要来源。然而中药存在成分组成复杂、作用靶标和途径复杂、整体药理药效复杂等特点,因此针对中药的复杂性,搞清其发挥疗效的物质基础与其防病治病的作用机理,是中药设计的核心任务。本研究以高脂血症为研究载体,以分子模拟、生物学评价相结合的研究方法,建立了中药降脂成分活性评价及作用机理解析的方法,发现了具有靶向性的中药降脂成分,为降脂中药成分的配伍与降脂中药设计提供基础与指导。本研究主要开展了以下三方面的研究内容:基于分子模拟的降脂中药有效成分发现;基于细胞实验验证中药候选成分及成分配伍的降脂活性;基于动物实验发现中药降脂提取物。1.基于分子模拟技术发现中药降脂有效成分本研究首先以代谢型谷氨酸受体4（Metabotropic glutamate receptor 4,mGluR4）、醛固酮合酶（Aldosterone synthase,CYP11B2）为研究载体,建立了利用分子模拟技术发现中药中潜在活性成分的方法。随后,选择降脂靶标肝X受体β（Liver X recptor β,LXRβ）和角鲨烯合成酶（Squalene synthase,SQS）为研究对象,利用分子模拟技术构建药效成分辨识模型。针对LXRβ,本研究基于活性化合物数目多及活性范围跨度大等特征,利用Hypogen模块构建LXRβ激动剂定量药效团模型;针对靶标SQS,基于22个已知活性高的活性化合物的结构特征,利用HipHop模块构建了 SQS抑制剂定性药效团模型。利用测试集对药效团模型进行评价。两个靶标的分子对接模型均能较好地重现原配体与受体之间的结合模式,可用于评价药效团命中结果并阐释配体-受体间相互作用机制。分别选择两个靶标的最优药效团模型筛选中药化学成分数据库（Traditional Chinese Medicine Database,TCMD）。LXRβ 激动剂的最优辨识模型对 TCMD 进行筛选,共得到309个潜在化合物,SQS抑制剂的最优模型筛选得到1200个潜在化合物。随后利用分子对接方法进一步精制筛选结果,基于原配体的打分值以及关键氨基酸建立筛选规则,得到去甲氧基姜黄素、异甘草黄酮醇、胀果甘草查尔酮E、水飞蓟宁等4个化合物为潜在的LXRβ激动剂,得到SQS-Comp.1为最具有潜力的SQS抑制剂。最后,基于实验室前期构建的四个降脂相关靶标的药效辨识模型,筛选得到4个对应各靶标的潜在活性化合物。本研究利用分子模拟技术发现潜在的降脂中药活性成分,为接下来的生物学验证提供了基础和指导。2.基于细胞实验发现中药降脂活性成分及成分配伍本研究基于3T3-L1和HepG2两种细胞系建立降脂中药有效成分及成分配伍的活性评价体系。经过文献调研,3T3-L1细胞系中存在微粒体三酰甘油转运蛋白（Microsomal triglyceride transfer protein,MTP）、烟酸受体等降脂相关靶标;HepG2 细胞系中存在 3-羟基-3 甲基戊二酸单酰还原酶 A（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A,HMG-CoA）、α-过氧化物酶增殖子激活受体（Peroxisome proliferator-activated receptor-α,PPAR-α）、固醇转运蛋白（Niemann-Pick C1-like 1,NPC1L1）、胆固醇酯转移蛋白（Cholesteryl ester transfer protein,CETP）、SQS等降脂相关靶标。基于3T3-L1细胞系评价中药成分的降脂活性,首先进行条件摸索,确定接种细胞数为1×105个/mL,细胞融合时间为60h,诱导剂地塞米松终浓度为1μmol/L,胰岛素终浓度为5μg/mL,IBMX终浓度为0.5 mmol/L。随后利用构建成功的细胞模型评价中药成分的降脂活性,选择各靶标对应的已上市西药作为阳性组,利用TG试剂盒检测细胞内TG含量的变化作为评价指标,与模型组相比较从而判断化合物的降脂作用。最后,采用MTT法进行中药成分毒性检测。实验结果表明,MTP-Comp.1在最佳浓度10μmol/L时,降低25.33%的TG,烟酸-Comp.1最佳浓度是50μmol/L,降低24.65%的TG,结果均可显著降低细胞内TG含量,且差异具有统计学意义。基于HepG2细胞系评价中药降脂活性成分,首先经过条件摸索,确定利用浓度为60 μg/mL的油酸钠作为诱导剂,诱导时间为24h,构建HepG2细胞系的高血脂症模型。选择各靶标对应的已上市西药作为阳性药,评价细胞高血脂症模型降脂药效的准确性。随后利用构建成功的细胞模型评价中药成分及成分配伍的降脂活性,评价指标为细胞内甘油三酯（Triglyceride,TG）含量的变化,与模型组相比较从而判断中药成分及配伍的降脂活性。最后,采用MTT法检测中药成分细胞毒性。实验结果显示,具有NPC1L1和SQS双靶作用的中药成分NPC1L1-SQS-Comp.1在最佳浓度为20 μmol/L时,可显著降低细胞TG含量,差异具有统计学意义,且可以降低TG含量的百分比为19.20%。针对靶标CETP,得到中药成分CETP-Comp.1在浓度为10 μmol/L时,可显著降低细胞内TG含量,差异具有统计学意义,且可以降低20.88%的TG。基于临床常用联合用药的降脂靶标组合HMG-CoA还原酶和PPAR-α,结合实验室已有的药效辨识模型筛选结果,20 μmol/LHMG-CoA-Comp.1 和 20 μmol/LPPAR-α-Comp.1 的配伍给药组可以降低19.95%的TG,成分配伍的降脂作用达到1+1＞2的效果,表明中药成分配伍具有更好的降脂作用。本研究利用3T3-L1细胞系和HepG2细胞系评价中药成分的降脂活性,最终得到4个中药成分和1对中药成分配伍具有明显的降脂活性,为降脂中药成分的配伍与降脂中药新药设计提供基础与指导。3.基于动物实验发现中药降脂提取物本研究基于细胞实验结果选择TCM-1提取物和TCM-2提取物进行动物降脂实验研究。首先,利用高脂饲料连续喂养2个月进行高血脂模型的构建,通过眼眶静脉丛取血的方式制备血清,利用TG、总胆固醇（Total cholesterol,TC）、低密度脂蛋白（Low density lipoprotein,LDL）、高密度脂蛋白（High density lipoprotein,HDL）试剂盒检测4个指标,结果表明TG、TC含量与正常组比较极显著升高（P＜0.001）,LDL与正常组比较含量显著升高（P＜0.01）,HDL含量与正常组比较含量显著降低（P＜0.01）,说明模型构建成功。实验一共72只大鼠,分为9组,每组8只,分别是正常组、模型组、阳性药组、TCM-1提取物高、中、低剂量组、TCM-2提取物高、中、低剂量组。连续给药4周后,检测指标,结果显示TCM-1提取物和TCM-2提取物在高剂量的条件下可以使TG、TC、LDL三个指标降低,HDL升高,且具有统计学意义,表明TCM-1提取物和TCM-2提取物具有降脂活性。本研究结合分子模拟技术和细胞、动物生物学评价的方法,发现了4个中药成分、1对中药成分配伍和2个中药提取物具有降脂活性,为降脂中药成分的配伍与降脂中药设计提供基础与指导。