研究背景和研究目的1.损伤识别机制的不同是转录偶联修复和泛基因组修复途径的主要区别核苷酸切除修复途径(NER)是DNA修复途径中最灵活的一种,它可以修复多个结构上不连续的DNA损伤。该系统的作用需要包括XPA、XPB、XPC、XPD、XPF、XPG与ERCC1在内的至少17种酶或蛋白质的活力。在NER中,限速步骤为DNA损伤的识别/切除。NER可分为两种亚途径:①泛基因组修复(Global genome repair,GGR)。②转录偶联修复(Transcription-coupled repair TCR)。这两种途径在开始部分有所不同,GGR作用于DNA的非转录区,TCR作用于活性转录区,一旦启动则两者利用的酶一样。如果损伤发生在DNA的非转录链,则发生泛基因组修复,XPC/hHR23B复合物的形成是NER损伤识别的起始阶段。如果损伤发生在转录链上的活性基因部位,则发生转录偶联修复,起转录作用的RNA聚合酶Ⅱ被阻滞,是导致TCR的迅速起始信号。在此过程中,一些错配修复过程中的蛋白CSA和CSB (CS,Cockayne syndrome,凯恩综合征)是必需的,CSA和CSB可能在使停滞的RNA聚合酶Ⅱ移动上起作用,以允许有足够的空间完成NER。这种修复比GGR迅速且效率也较高。2.顺铂和UV介导的DNA损伤理论上均可介导TCR的发生在众多外源性DNA损伤因素中,以顺铂(cisplatin)和紫外辐射研究的最多(UV)。顺铂形成链内加合物(Pt-DNA)及DNA交联(DNA-crosslink)而损伤DNA,阻止DNA复制,其中1-2链内交联占90%以上,少数为1-3链内交联。紫外线照射主要导致环丁烷嘧啶二聚体(cyclobutane pyrimidine dimers,CPDs)和6-4光产物的形成损害DNA。紫外辐射引起DNA损伤的根本原因在于其能诱发DNA同条链内相邻的嘧啶碱基产生嘧啶二聚体,使DNA空间结构发生变化,从而阻碍了DNA复制、转录进而影响蛋白质的生物功能。顺铂和UV介导的DNA损伤共同点在于均可导致DNA链内或链间交联,使DNA双螺旋的空间结构发生变化,阻碍DNA的转录,理论上均可介导转录偶联修复途径的发生。3.顺铂和UV介导的TCR和突变发生的关系缺少正常细胞内的实验证据已有的体外研究表明,UV导致的CPDs损伤在可表达基因转录链上的修复比在非转录链上要迅速得多。相反,在可表达序列和非表达序列上的6-4光化合产物均能得以充分清除;顺铂导致的1-2链内交联在体外实验中亦可诱导TCR的发生,在人类细胞的核裂解液中发现,1-3链间交链同样可阻滞RNAPⅡ的转录作用。目前对UV和顺铂DNA损伤的细胞内研究主要以缺陷细胞为工具,如GGR缺陷细胞XPA、XPC等,TCR缺陷细胞CSA、CSB等,利用缺陷细胞内GGR或者TCR途径缺失的特点,可以单独研究某一种修复途径的分子机制,但缺陷细胞总体的DNA修复功能是不健全的,相对于正常细胞,不能真实反映细胞内生理状态下修复和突变的发生情况。4.如何在同一种细胞内实现GGR途径和TCR途径的单独作用是在正常细胞内研究TCR与突变分子机制的关键问题。HEK293细胞内的各种修复途径均正常,DNA受到机体内外各种因素的损伤后,细胞会启动包括TCR和GGR在内的各种途径进行修复,突变的产生是各种修复途径综合作用的结果。为了实现在同一种细胞内GGR和TCR途径的单独作用,需要设计一种可控的报告基因转录模型,通过人为控制报告基因的转录实现转录偶联修复途径的启动,从而达到转录偶联修复和泛基因组修复的分离。5.本实验的设计思路和研究目的①突变研究实验模型的设计四环素正调节的基因表达系统,称为Tet-on基因表达系统。理论上在没有四环素的情况下目的基因表达水平为零,而在加入四环素衍生物强力霉素(doxycycline,Dox)后目的基因高效表达。SupF基因所编码的tRNA,能识别宿主菌lacZ基因的琥珀型突变,产生正常的β-半乳糖苷酶,在含β-半乳糖苷酶底物X-gal和lac操纵子诱导物IPTG以及相应抗性的LB指示平板上,其菌落呈现蓝色。当SupF基因发生突变,影响或完全丧失其所编码的tRNA功能时,其菌落呈现淡蓝色或白色。本实验中,我们将Tet-on基因表达调控系统和SupF tRNA转运系统相结合,构建了一种可控转录系统。以SupF为损伤靶基因,UVC和顺铂体外损伤后,转入Tet-on293细胞进行修复和扩增,最后转化细菌挑取白色突变克隆,突变子DNA测序分析,来确定突变形成的分子机制和突变发生的冷热点。②本实验的研究目的综合目前转录偶联修复的研究进展,本课题主要围绕转录偶联修复在顺铂和UV导致的DNA损伤和突变过程中的作用机制进行研究,拟通过基因重组、质粒转染、定标性突变研究、蓝白斑筛选、DNA测序等技术,在分子水平探讨下面几个问题:①在同一细胞内如何实现GGR与TCR途径单独作用;②UV和顺铂造成的DNA损伤能否诱导转录偶联修复途径的发生;③UV和顺铂介导的转录偶联修复过程中报告基因突变频谱的特点;④转录偶联修复途径介导突变发生的可能分子机制;方法:1.双向启动、双报告基因的穿梭质粒pTCR-SupF-Luc构建及鉴定以Tet-on反应质粒pBI-L为载体,插入来源于质粒pSupF-G1的突变报告基因SupF片断,再设计一段引物,从质粒pEGFP-1扩增SV40 ori/Kan/Neo片断,合适的酶切处理后,与已经亚克隆一次的载体质粒连接,最终得到目的质粒pTCR-SupF-Luc,并通过酶切鉴定和测序分析等手段验证插入序列的位置和碱基顺序的正确性,为下一步研究提供敏感、可靠的实验工具。2. Tet-on调控的SupF tRNA转运系统的建立和功能验证完整的Tet控制系统由Tet调节质粒和Tet反应质粒构成,Tet-on293细胞为稳定转染了Tet调节质粒pTET-ON质粒的人HEK293细胞,在本实验中作为调节系统,已经构建并测序验证后的pTCR-SupF-Luc为反应系统。培养Tet-on293细胞,阳离子脂质体转染法将pTCR-SupF-Luc瞬时转染Tet-on293细胞,8 h后更换完全培养液,加入终浓度为1μg/ml的强力霉素(DOX)诱导转录,48h后检测Luciferase基因表达情况验证转录是否得以进行。裂解细胞,提取质粒,纯化后转化专用菌SY204验证SupF报告基因活性。3. UVC介导的转录偶联修复与突变发生分子机制的研究UVC(波长254nm的短波紫外线)体外损伤pTCR-SupF-Luc质粒,剂量为1500J/M2,损伤后的质粒阳离子脂质体法转染Tet-on293细胞,细胞分为加药组和对照组,8h后更换完全培养液,加药组加入终浓度1μg/ml的DOX,各组细胞继续培养48h,使质粒得以充分复制和修复。取部分细胞,裂解后测Luciferase基因表达情况,若明显升高说明SupF报告基因转录已经启动,裂解剩余细胞,提取质粒,转化SY204细菌,通过蓝白斑筛选挑取白色突变克隆,计算突变频率=突变的白色菌落数/总菌落数。扩增后测序获得突变频谱,分别对转录和非转录状态的突变情况进行对比,分析UVC介导的转录偶联修复过程中突变产生的分子机制。4. TCR在顺铂导致的SupF基因损伤和突变发生中的作用机制研究pTCR-SupF-Luc质粒100μg,加入终浓度50uM的顺铂溶液,总体积200μl,室温下放置4h,使质粒充分染毒,形成DNA交联。酚:氯仿抽提,无水乙醇沉淀得到纯化质粒,阳离子脂质体法转染Tet-on293细胞,进行定标性突变研究,通过细菌的蓝白斑筛选挑取突变克隆确定突变频率和DNA测序,分别测定转录与非转录状态下SupF的突变特点,分析转录偶联修复在顺铂致突变过程中的作用机制。结果1.成功构建了双向启动、双报告基因的穿梭质粒pTCR-SupF-Luc,经过酶切鉴定和测序验证,确定插入片断的位置符合设计要求,碱基序列与来源序列同源性100%。2.将Tet-on293细胞与pTCR-SupF-Luc质粒相结合,建立了Tet-on调控的SupF tRNA转运系统,经过Luciferase基因检测和SupF基因活性测定,证明了该系统的可控性和敏感性,本系统的具有以下特点:①SupF突变报告基因的转录可通过Tet-on系统精确调控;②双报告基因:Luciferase基因、SupF基因,通过检测Luciferase基因的表达可以明确SupF基因是否得以转录,进而明确是否诱发TCR途径;③穿梭质粒,pTCR-SupF-Luc质粒中含有原核细胞复制子Col E1和真核细胞复制子SV40ori,可以在细菌和哺乳动物细胞中存活和复制,使得在哺乳动物细胞中发生的遗传学事件,能很方便地在细菌中得到报道;④SupF基因很小,遗传背景清楚,通过DNA测序来定位突变热点及上下游序列变得相对容易。3.得到SupF突变报告基因由UVC诱导的在不同转录状态下的突变频率和突变频谱。TCR途径,SupF基因诱导转录,突变频率为2.2%,突变热点集中在5’-CG-3’、5’-CC-3’、5’-TC-3’区域;GGR途径,SupF基因转录沉默,突变频率为1.2%,突变热点集中在5’-GGGGGGG-3’、5’-CC-3’、5’-TT-3’区域。突变频谱见下表所示。4.得到顺铂诱导的SupF基因在不同转录状态下的突变频率和突变频谱,TCR途径,SupF基因诱导转录,突变频率为1.45%,突变热点集中在5’-CG- 3’、5’-GCCG-3’区域;GGR途径,SupF基因转录沉默,突变频率为1.20%,突变热点集中在5’-GGGGGGG-3’、5’-GGGA-3’、5’-GAAG-3’区域。突变频谱见下表所示。结论1.本研究成功构建了用于转录偶联修复研究的双向转录、双报告基因的Tet-on反应质粒pTCR-SupF-Luc。2.本研究利用Tet-on293细胞和重组质粒pTCR-SupF-Luc组成可控的SupF报告基因定标性突变研究系统,经功能验证符合理论预期,为研究转录偶联修复与突变发生的分子机制提供理想的实验模型。3.在正常人类细胞内报道了转录偶联修复参与UVC和顺铂介导的DNA损伤修复过程。4. UVC介导的CPDs损伤(环丁烷嘧啶二聚体)和顺铂导致的cis-1.3-d(GTG)链内交联主要由TCR优先修复。5.首次在SupF基因中确定了正常细胞TCR和GGR两种修复状态下突变频谱的特征性差异。6.通过对突变频谱的分析发现,在UV和顺铂介导的DNA损伤修复过程中,TCR和GGR有着不同的“突变指纹”,提示TCR在修复两种损伤过程中存在序列依赖性,两种NER修复途径对维持基因组遗传稳定性可能起不同而又互补的作用。