【摘 要】
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【目的】观察罗汉果苷V对高脂饲料联合来曲唑致多囊卵巢综合征（PCOS）模型大鼠的影响,探讨并初步阐释罗汉果苷V对PCOS模型大鼠卵泡发育的影响及其作用机制。【方法】45只5周龄雌性SD大鼠适应性喂养1周后,随机选取15只作为对照组（Control组）,给予普通饲料喂养,并予溶媒（0.1%羧甲基纤维素钠）灌胃30天;其余大鼠给予高脂饲料联合来曲唑（1 mg/kg·d）灌胃造模,持续30天。在造模的第
【基金项目】
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湖南省教育厅重点项目,名称:卵泡液外泌体传递的miRNA-34a调控LDHA在PCOS卵泡发育障碍中的作用及机制研究（No.20A434,2020/01-2022/12）； 湖南省自然科学基金项目,名称:基于miRNA-500-3P/LDHA调控乳酸生成探讨罗汉果甜苷改善PCOS大鼠卵泡发育障碍的作用机制（受理编号:S2022JJMSXM1869,2022/01-
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【目的】观察罗汉果苷V对高脂饲料联合来曲唑致多囊卵巢综合征（PCOS）模型大鼠的影响,探讨并初步阐释罗汉果苷V对PCOS模型大鼠卵泡发育的影响及其作用机制。【方法】45只5周龄雌性SD大鼠适应性喂养1周后,随机选取15只作为对照组（Control组）,给予普通饲料喂养,并予溶媒（0.1%羧甲基纤维素钠）灌胃30天;其余大鼠给予高脂饲料联合来曲唑（1 mg/kg·d）灌胃造模,持续30天。在造模的第21天开始,对大鼠进行连续10天的阴道涂片检查。造模结束后,将模型组随机分为2组,即模型对照组（PCOS组,n=15）和罗汉果苷V干预组（PCOS-MV组,n=15）。Control组予普通饲料喂养,PCOS组继续予高脂饲料喂养,PCOS-MV组给予普通饲料喂养和罗汉果苷V（600 mg/kg/d）灌胃,持续30天。在药物干预的第21天开始,进行连续10天的阴道涂片检查。实验结束后,收集各组大鼠血清,放射免疫法测定生殖激素浓度;苏木精-伊红染色（HE）观察卵巢内卵泡发育情况;合笼实验检测大鼠生育力。靶向代谢组学测定各组大鼠卵巢能量代谢产物浓度;转录组测序分析各组大鼠卵巢中的基因表达水平和差异表达基因,富集并筛选糖酵解通路的差异表达基因。实时荧光定量PCR（QRT-PCR）、Western blotting和免疫组化等实验技术检测卵巢中乳酸脱氢酶A（LDHA）、己糖激酶2（HK2）和M2-型丙酮酸激酶（PKM2）的表达情况。体外高雄激素处理KGN细胞,用不同浓度罗汉果苷V（0、25、50、100 nmol/L）干预,CCK-8检测细胞活力变化,ELISA测定细胞乳酸和丙酮酸的产量,QRT-PCR、Western blotting检测各组细胞中LDHA、HK2和PKM2的表达差异。【结果】1.与对照组相比,PCOS组大鼠体重、血清睾酮（Testosteron,T）和卵巢重量显著增加（P＜0.05）;动情周期紊乱,多处于动情间期;卵巢内结构紊乱,可见多个囊状卵泡、卵泡颗粒细胞层数减少;黄体数量和生育力显著降低（P＜0.05）;罗汉果苷V干预后,与PCOS组相比,大鼠体重、血清T和卵巢重量显著降低（P＜0.05）;动情周期逐渐规律;卵巢内囊状卵泡数量明显减少、卵泡中颗粒细胞层数增加;黄体数量增加和生育力显著提高（P＜0.05）。2.靶向代谢组学结果分析显示,与对照组比较,PCOS组大鼠卵巢能量代谢通路紊乱,其中糖酵解通路中丙酮酸浓度显著升高、乳酸浓度显著降低（P＜0.05）;罗汉果苷V干预后卵巢中乳酸浓度显著增加、丙酮酸浓度显著下降（P＜0.05）;3.转录组学结果分析显示各组大鼠卵巢样本组内重复性较好,PCOS组卵巢中基因表达变化与对照组之间存在明显差异,KEGG/GO分析结果显示,差异表达基因可显著富集到糖酵解等信号通路,罗汉果苷V干预后,糖酵解等信号通路中基因的表达水平与对照组趋于一致。4.与对照组相比,QRT-PCR、Western blotting实验结果均显示:糖酵解关键限速酶基因LDHA、HK2和PKM2在PCOS大鼠卵巢中的表达显著下调,罗汉果苷V干预后可显著上调其表达水平（P＜0.05）。免疫组化结果显示:LDHA、HK2和PKM2蛋白主要表达于卵巢颗粒细胞胞质中,且均在对照组和罗汉果苷V干预的PCOS大鼠卵巢的颗粒细胞中可见较强阳性信号,而PCOS组卵巢中的阳性信号较弱。5.在体外培养的KGN细胞中发现:添加高雄激素可降低细胞活力、抑制乳酸和丙酮酸生成（P＜0.05）;同时QRT-PCR、Western blotting实验结果均显示:糖酵解关键限速酶基因LDHA、HK2和PKM2显著下调;罗汉果苷V显著提高了高雄激素处理的KGN细胞活力,促进了乳酸和丙酮酸生成,并上调了LDHA、HK2和PKM2的表达（P＜0.05）。【结论】罗汉果苷V可参与调控卵巢颗粒细胞的糖酵解代谢,促进乳酸生成,改善PCOS大鼠卵泡发育。
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