研究背景近10年来,临床回顾性分析研究已经证实,新生儿及婴幼儿早期接受全身麻醉和镇静,可引起随后的神经系统功能障碍,包括学习能力下降、认知功能减弱等。这一结果,不仅引起医疗专家的关注,也引起了管理者和患儿家长的广泛重视。尤其,随着孕期妇女非产科手术比例的增加(0.15%-2%),全身麻醉是否会影响胎儿神经系统的发育,导致出生后的神经系统功能障碍,成为临床麻醉关注的热点问题。静脉麻醉药物丙泊酚(又名异丙酚,英文名称Propofol,化学名2,6-二异丙基苯酚)因起效迅速、代谢快而完全、苏醒快而平稳、不良反应少等优点被广泛应用于各类手术的全麻诱导和维持中,尤其适用于婴幼儿手术麻醉、气管插管、内镜检查等操作和ICU的镇静。然而,与其他麻醉药物的神经毒性作用相似,研究发现,早期接触丙泊酚也可引起发育中大脑广泛的神经元细胞凋亡,导致长期的神经系统功能障碍,如学习、认知能力下降。进一步研究还证实,丙泊酚可影响突触的形成过程,通过影响树突棘的形态和浓度,突触结构的数量来改变神经信号的传导,最终导致神经系统发育畸形,出现行为的异常。突触的形成是由多种基因、蛋白质参与的复杂的生理过程。其中mbp和synapsin Ha (syn2a)基因在突触的形成过程中发挥重要作用。Abp基因通过转录、翻译,编码形成鞘磷脂蛋白(Myelin basic protein, Mbp)。Mbp是少突胶质细胞特异性表达的一种蛋白,其围绕神经元的轴突形成髓鞘,是保证神经信号快速、单向传导的重要结构。如果Mbp蛋白表达异常,导致髓鞘的形成受到损害、减少甚至缺失,不仅会影响神经信号的传递,也会导致硬化相关性疾病的发生,主要表现为认知功能的障碍、语言、视力减弱、震颤、肌痉挛等。Syn2a基因是调节突触结构形成的基因,其表达的异常会直接影响突触结构的形态及数量。然而,目前关于丙泊酚对mbp和syn2a基因及蛋白表达影响的研究较少,尤其是胚胎期丙泊酚暴露,是否会通过影响mbp、syn2a基因和蛋白的表达导致神经系统发育障碍?为解决这一疑问,需要更多的研究探讨丙泊酚暴露对mbp和syn2a基因及蛋白表达的影响及相关的分子机制。研究发现,丙泊酚的神经毒性作用具有时间依赖性,即在突触发育的关键时期(相当于啮齿类动物出生后7-14天左右)最为敏感。因此,目前相关的实验动物均选取出生后7-15天的幼鼠。那么,对于神经发育的起始阶段-胚胎期,神经干细胞向各级神经元分化、迁移、增殖的重要时期,是否对丙泊酚更加敏感?在此期间接受丙泊酚暴露是否会影响胚胎发育?是否会诱导细胞的凋亡甚至影响mbp和syn2a基因及蛋白的表达呢?探讨这一系列问题具有重要的研究价值和意义。这不仅是丙泊酚神经毒性研究在作用时间上的扩展,更是机制研究的深入。由于哺乳动物胚胎宫内发育的特点,目前较少有丙泊酚对活体胚胎期生物神经系统发育影响的文献报道,因此,需要建立新的动物模型,探讨胚胎期丙泊酚暴露的神经毒性作用。斑马鱼的出现,解决了哺乳类动物无法解决的问题。斑马鱼做为一种新型模式动物,因其胚胎体外受精、体外发育,且胚胎透明、易于观察与操作等特点,已广泛应用于神经发育、神经损伤和神经行为学等神经科学研究。尤其斑马鱼胚胎透明,易于观察与操作等优势,已成为筛查药物胚胎期神经毒性的首选模式动物。通过免疫荧光、荧光探针、活体成像等技术可直接观察活体动物体内细胞或蛋白表达的变化。更值得一提的是,斑马鱼因繁殖周期短,生产量等优势,不仅降低了构建转基因鱼的技术难度,还大大缩短了时间和经济成本。因此,凭借斑马鱼模式动物的诸多优势,本研究通过建立胚胎期斑马鱼丙泊酚暴露模型,探讨胚胎期丙泊酚暴露对斑马鱼胚胎发育的神经毒性作用,包括对胚胎发育生存率、孵化率和畸形率的影响；对胚胎细胞凋亡的影响及对mbp和syn2a基因及蛋白表达的影响。研究成果,不仅能为基础研究提供新的理论依据,更重要的是可为临床应用提供重要参考,为如何安全有效的开展孕妇及新生儿、婴幼儿麻醉工作,提供科学依据。研究目的1.建立胚胎期斑马鱼丙泊酚暴露模型；2.探讨胚胎期丙泊酚暴露对斑马鱼胚胎发育过程中生存率、孵化率和畸形率的影响及对7dpf幼鱼脑组织结构的影响；3.探讨胚胎期丙泊酚暴露对斑马鱼胚胎及幼鱼细胞凋亡的影响及相关的分子制：4.探讨胚胎期丙泊酚暴露对斑马鱼mbp和syn2a基因及蛋白表达的响。研究内容与方法1.建立胚胎期斑马鱼丙泊酚暴露模型目前,尚无采用斑马鱼研究丙泊酚神经毒性作用的相关文献报道,因此,本研究的第一部分内容是建立斑马鱼胚胎丙泊酚暴露模型。以受精后的斑马鱼胚胎和幼鱼为研究对象,通过检测不同时间和不同浓度丙泊酚暴露下,胚胎发育孵化率、畸形率和生存率的变化来确定合理的暴露浓度和时间。具体内容如下：1)为确定斑马鱼胚胎丙泊酚暴露浓度和暴露时间,将受精后6-48小时(6-48hpf,hours post-fertilization)的胚胎浸泡于含不同浓度丙泊酚(1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、9μg/ml)和含相同剂量DMSO(丙泊酚溶剂,0.013%)及空白对照幼鱼孵化水中。24hpf时将各组受试液均更新一半(含丙泊酚和DMSO溶液),48hpf全部更换为孵化水。2)为检测胚胎期丙泊酚暴露的一般毒性作用,分别在24、48、72、96和120hpf时,记录各实验组胚胎生存率、孵化率、畸形率以及畸形特征。3)为检测胚胎期丙泊酚暴露对脑部发育的影响,取暴露后7dpf (days post-fertilization)幼鱼,通过HE染色检测其脑部细胞数量和脑室腔的变化。4)为检测丙泊酚的麻醉效果,取健康6dpf幼鱼分别浸泡于含不同浓度丙泊酚(1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml)、含相同剂量DMSO(0.013%)及空白对照养鱼水中,浸泡30min后全部更换为新鲜养鱼水,观察24h。通过记录各组幼鱼麻醉起效时间、复苏时间及死亡率来评价丙泊酚的麻醉效应。2.检测胚胎期丙泊酚暴露的神经毒性作用哺乳类动物实验研究已经证实,出生后早期丙泊酚暴露可以引起发育中大脑广泛的神经细胞凋亡。因此,胚胎期斑马鱼丙泊酚暴露模型建立成功后,第二部分研究内容就是检测胚胎期丙泊酚暴露对细胞凋亡的影响及可能的分子机制。同时,进一步探讨了胚胎期丙泊酚暴露对mbp和syn2a基因及蛋白表达的影响。具体内容如下：1)为检测胚胎期丙泊酚暴露的促细胞凋亡作用,取暴露后36hpf胚胎,通过整体吖啶橙染色,比较各组胚胎整体凋亡细胞数量的变化。2)为检测丙泊酚促细胞凋亡作用的机制,取暴露后36hpf胚胎,通过qRT-PCR检测凋亡信号传导通路相关基因caspase-3、caspase-8和caspase-9 mRNA表达的变化。3)为检测丙泊酚对孵化后幼鱼的神经毒性作用,取经暴露后3dpf幼鱼,通过整体吖啶橙染色,比较各组幼鱼脑部凋亡细胞的变化。4)为检测丙泊酚对孵化后幼鱼的神经毒性作用,取经暴露后3dpf幼鱼,通过qRT-PCR、整体原位杂交技术和western blots法,分析mbp和syn2a基因及蛋白表达的变化。研究结果1.1、2、3μg/ml丙泊酚是研究胚胎期丙泊酚神经毒性作用的最佳浓度将6-48hpf斑马鱼胚胎浸泡于含不同浓度丙泊酚、DMSO和空白对照幼鱼孵化水中发现,在1、2、3μg/ml丙泊酚暴露组,从24hpf至120hpf,胚胎发育的生存率均高于93%,与空白对照组和DMSO组比较,无显著性差异。DMSO组与空白对照组比较,各时间点生存率也无显著差异。然而,在4、6、9μg/ml丙泊酚暴露组,胚胎及幼鱼的生存率显著下降(P<0.05),且分别在96hpf (6μg/ml丙泊酚组)和48hpf (9μg/ml丙泊酚组)全部死亡。比较各实验组胚胎孵化率发现,与空白对照组和DMSO组比较,1、2、3μg/ml丙泊酚暴露组的胚胎孵化率在48hpf (P<0.05)和72hpf (P<0.05)均显著降低；DMSO组与空白对照组相比,无显著性差异(P>0.05)。比较各实验组5dpf幼鱼畸形率也发现,丙泊酚暴露组畸形率显著增高(P<0.05)；DMSO组与空白对照组相比,无显著差异(P>0.05)。幼鱼的畸形主要表现为：心包囊肿、脊柱弯曲、眼睛变小和出血等。以上结果显示,胚胎期1、2、3μg/ml丙泊酚暴露对胚胎发育具有毒性作用,表现为延缓胚胎孵化率,增加胚胎发育的畸形率。但在此浓度暴露下的斑马鱼从胚胎到幼鱼,生存率均无显著变化,提示1、2、3μg/ml丙泊酚是探讨胚胎期斑马鱼丙泊酚暴露神经毒性作用的最佳浓度。2.1、2、3μg/ml丙泊酚具有麻醉效果由于斑马鱼体积较小,无法精确测量经浸泡后幼鱼体内丙泊酚的血药浓度。为检测该浓度下丙泊酚的麻醉效应,将6dpf幼鱼浸泡于含不同浓度丙泊酚、DMSO及空白对照养鱼水中30min。对针尖触碰鱼尾无反应,且无自主运动能力的幼鱼被认为进入麻醉状态。结果显示,在1、2、3μg/ml丙泊酚组,各组幼鱼均在90s内进入麻醉状态,平均时间(s)分别为60(45,75)、45(30,60)、30(30,45),空白对照组和DMSO组幼鱼均可自由游动。麻醉30min后,各组幼鱼复苏时间从60min-150min不等,平均时间(min)分别为75(75,90)、120(105,120)、120(120,135)。麻醉及复苏后24h内,无幼鱼死亡。综上所述,1、2、3μg/ml丙泊酚是研究胚胎期丙泊酚暴露神经毒性作用的最佳浓度,不仅对胚胎发育具有一定毒性作用,而且对幼鱼具有临床麻醉效应,符合研究药物毒性作用的实验要求。3.丙泊酚可影响7dp坳鱼脑组织结构比较经胚胎期1、2、3μg/ml丙泊酚暴露,发育至7dpf幼鱼的脑部组织结构可见,与对照组相比,丙泊酚处理组幼鱼脑组织结构腔隙增大,细胞数量减少。提示,胚胎期丙泊酚暴露对斑马鱼脑部发育具有毒性作用。4.丙泊酚可诱导36hpf胚胎细胞凋亡增加,上调‘caspase-3、-8和-9mRNA表达研究已经证实,丙泊酚可引起发育中大脑广泛的神经元细胞凋亡,那么对于斑马鱼是否具有相同的作用呢?本研究显示：在对照组中,36hpf胚胎整体未见明显的凋亡细胞信号；在1、2、3μg/ml丙泊酚组,在胚胎头部、尾部均可见凋亡细胞,数量明显增多。Caspase家族参与的信号传导通路是启动细胞凋亡程序的重要机制之一,其中caspase-3、caspase-8和caspase-9在此过程中发挥关键作用。本研究发现,与对照组相比,丙泊酚暴露组胚胎体内caspase-3、-8、-PmRNA表达均显著增高(P<0.05)。进一步分析还发现,caspase-8和caspase-9在三个剂量丙泊酚暴露组的表达呈剂量依赖性上调(P<0.05)。以上结果提示,胚胎期丙泊酚暴露引起的促细胞凋亡作用可能与caspase信号通路的激活有关,且丙泊酚的神经毒性作用随着药物浓度的增高而增强。5.丙泊酚可诱导3dpf幼鱼脑部细胞凋亡增多3dpf是斑马鱼胚胎孵化为幼鱼的关键时期,为检测丙泊酚促细胞凋亡作用的持续性,本研究分析了3dpf幼鱼脑组织中凋亡细胞数量的变化。结果显示,与对照相比,丙泊酚暴露组脑部凋亡细胞的数量显著增多(P<0.05)。并且,3μg/ml丙泊酚暴露组脑部凋亡细胞数量高于1μg/m1丙泊酚暴露组(P<0.05)。提示丙泊酚的促细胞凋亡作用具有持续性,且随着药物浓度的增高而增强。6.丙泊酚可下调mbp mRNA及蛋白的表达Mbp和syn2a基因是突触形成过程中发挥重要作用的两种基因。然而,目前很少有研究探讨丙泊酚对此两种基因表达的影响。本研究发现,经胚胎期1、2、3μg/ml丙泊酚暴露后,各组3dp坳鱼mbp mRNA表达显著下降(P<0.05)。通过整体原位杂交法发现,mbp mRNA下调程度可分为三个级别：无变化、轻度下降和严重下降。整体原位杂交结果还显示,mbp mRNA表达的下降主要表现在中枢神经系统,外周神经系统的表达无显著差异。Mbp蛋白检测也显示一致结果,与对照组相比,丙泊酚暴露组幼鱼Mbp蛋白的表达呈剂量依赖性下降(P<0.05)。然而,分析发现,与对照组相比,丙泊酚暴露组幼鱼syn2a基因mRNA的表达无显著差异(P>0.05)。结论1.将6-48hpf斑马鱼胚胎通过浸泡方式暴露于含1、2、3μg/ml丙泊酚幼鱼孵化水中,是研究胚胎期丙泊酚暴露神经毒性作用的最佳动物模型；2.胚胎期丙泊酚暴露对斑马鱼胚胎发育具有毒性作用,表现为：延迟胚胎孵化的时间,引起胚胎发育的畸形及影响脑组织结构的正常发育；3.胚胎期丙泊酚暴露可引起胚胎整体细胞凋亡增多,且细胞凋亡的发生可能与caspase-3、-8、-9参与的信号通路的激活有关。4.胚胎期丙泊酚暴露的神经毒性作用具有持久性,在暴露后24h,丙泊酚仍可诱导幼鱼脑部细胞凋亡增加,且明显抑制mbp基因mRNA和蛋白的表达。