论文部分内容阅读
在农业生产过程中,植物病原真菌和细菌很易感染植物,每年造成巨大的经济损失。化学农药曾经在植病防治上发挥了巨大的作用,但是它引起土壤、水体和大气的污染,农副产品中农药残留增加,直接危害了人类的健康及生存,以及病原菌的抗药性等问题,由此加速了人们去寻求新的安全有效的植物病害防治途径,生物防治便是其中一种有效的防治途径。本研究以西瓜枯萎尖镰胞菌(Fusarium oxysporum f.sp.melonis)为指示菌,通过NA平板初筛,从实验室保存的482株细菌中得到了17株可以抑制西瓜枯萎尖镰胞菌生长的拮抗菌株,抑菌带宽度达到8.5~26 mm。经过多次传代,保留10株抑菌圈带宽度稳定在10 mm以上的拮抗菌株。同时测得其中BS-3、BS-5、BS-17等菌株对多种植物病原真菌有不同程度的抑制作用。温室盆栽实验表明,BS-3、BS-5、BS-17对西瓜枯萎病的防病效果分别为25.70%、81.77%和41.27%。在湖北省农科院的大田试验重复测定BS-5对西瓜枯萎病的防病效果,发现其防病效果达到了84.58%。由此可见,BS-5对于防治西瓜枯萎病具有良好的效果,有作为生防制剂的潜力。通过形态和生理生化特征初步鉴定菌株BS-5为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis),16S rDNA序列分析进一步确定该菌株为枯草芽胞杆菌。通过硫酸铵分级盐析法对BS-5所产拮抗物质进行了初步提取,发现当硫酸铵饱和度在40%以下时,沉淀物基本无拮抗活性;硫酸铵饱和度在40%~80%之间,基本可以将拮抗物质完全沉淀。在此基础上,初步研究了拮抗粗提物的理化性质。实验结果表明,BS-5拮抗粗提物经100℃处理20 min之后的活性可保存70%以上,121℃处理20 min后的抑菌活性明显下降到35.92%;将拮抗粗提物经氯仿、无水乙醇、乙腈等有机溶剂处理后其抑菌活性基本保持不变;而经紫外线、蛋白酶和高离子强度处理后抑菌活性保持80%以上;在pH 5~8之间活性稳定;BS-5拮抗物质的茚三酮反应呈阴性,酸水解后茚三酮反应呈阳性,双缩脲反应也呈阳性。以金氏培养基为出发培养基,通过摇瓶发酵优化试验,得到BS-5生长的培养基组成和培养条件为:葡萄糖60 g/L,豆粕20 g/L,酵母粉3 g/L,K2HPO4·3H2O1 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L;培养温度30℃,种龄8 h,接种量2%,在500 mL摇瓶中装液量为30 mL,初始pH 7.5,最终生物量达到6.2×109 cfu/mL。在3 L发酵罐中进行BS-5发酵工艺优化,将豆粕浓度提高到40 g/L,此时生物量可以达到8.2×109 cfu/mL;在补糖发酵试验中,初始糖浓度为20 g/L,当葡萄糖浓度低于10 g/L时,补加葡萄糖(每次补加量为20 g/L,共补加两次),生物量提高到2.8×1010 cfu/mL。