截止到2020年,乳腺癌正式成为全球发病率最高的癌症。肿瘤标志物的检测对乳腺癌的早期筛查、动态监测、化疗耐药及预后评估等意义重大,但传统的检测手段都存在一定的局限性,难以实现快速、即时检测。CRISPR/Cas技术作为一种新兴技术,被认为是下一代诊断技术的核心。CRISPR/Cas技术构建的生物传感器具有灵敏度高、特异性强等优势,在即时检测上潜力巨大。因此,本文将CRISPR/Cas12a系统引入三种不同类型的乳腺癌肿瘤标志物(端粒酶、PIK3CAH1047R、miR-21)的检测中,旨在为构建更灵敏、便捷的乳腺癌肿瘤标志物传感平台提供新的方法和思路,也为CRISPR/Cas系统拓展新的应用领域。主要研究成果如下:（1）构建了一种基于端粒酶延伸激活子来解锁CRISPR/Cas12a的ssDNase活性的传感器检测端粒酶活性,实现了对MCF-7细胞端粒酶活性的超灵敏和即时检测。引物在端粒酶的作用下不断延伸,扩增出的片段可被crRNA识别,从而激活Cas12a的反式切割活性,实现了信号的双重放大。荧光和侧向流式试纸条检测端粒酶活性的检测限分别低至57 cells/mL和5.7×10~2 cells/mL,检测时间约为1 h。此外,该传感器在乳腺癌细胞亚型的分类中也具有一定的潜力。所构建的荧光检测方法及基于试纸条的POCT平台灵敏度高、简便快捷,为端粒酶活性的检测提供了一种新的方法和思路。（2）结合FspI内切酶、级联链置换扩增（C-SDA）和CRISPR/Cas12a的反式切割活性建立了针对PIK3CAH1047R基因突变的荧光生物传感器,实现了对该突变基因的超灵敏检测。突变基因PIK3CAH1047R可以与互补序列结合形成完整的核酸内切酶FspI识别位点。在FspI作用下,突变型基因在突变位点处发生裂解,产生可诱导SDA或C-SDA的DNA片段。与常规的SDA相比,本文改进的SDA在其DNA模板中多设计了一个Nt.BbvCI位点,实现了级联扩增,其扩增效率提高了两个数量级。扩增出的单链DNA,作为激活子可激发CRISPR/Cas12a体系的反式剪切能力。在优化的条件下,可以检测出低至0.001%的PIK3CAH1047R基因突变。此外,该生物传感器在人血清样本加标回收实验中表现良好,具有检测低丰度基因PIK3CAH1047R突变的潜力。（3）构建了一种基于多重级联链置换扩增（MC-SDA）和CRISPR/Cas12a反式切割活性检测miR-21的生物传感平台,实现了miR-21的灵敏检测。靶标作为引物触发C-SDA核酸放大过程。在此基础上引入一个新的模板,C-SDA的中间产物能与其结合触发又一个SDA循环放大过程,实现了多重级联扩增（MC-SDA）。所改进的MC-SDA方法表现出更高的扩增效率。MC-SDA的产物作为激活剂又能解锁CRISPR/Cas12a的反式切割活性,进一步提高了传感器的性能,实际检测限达到了10 fM。此外,该生物传感器在选择性和人血清样本加标实验中表现良好,具有一定的实际应用潜力。