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鉴于化疗、放疗对肿瘤治疗的局限,通过调动肿瘤患者自身潜能,抵抗肿瘤的免疫性治疗显得更为理性。它不仅对前者抑癌作用是有效补充,而且对患者机体机能状态是一种有力的调整与支持,因此,一直被期待着。近年来,随着免疫学研究的发展,特别对树突状细胞(DC)及一些细胞因子在免疫反应中作用认识的深入,使肿瘤的免疫治疗有了新的思路抗肿瘤疫苗是肿瘤肿免疫治疗中有良好前景的方法之一,其中DC疫苗,受到更多关注。如何使DC呈递的肿瘤抗原更特异,对T效应细胞的激发更有力,是当今研究的热点。CD40与配体CD40L(CD154)在免疫系统存在于不同细胞表面,二者相互作用,对于调节体液与细胞免疫反应具有枢纽作用。近年研究发现,CD40信号的激活可为恶性肿瘤治疗开拓新的途径,一定状态下,CD40L与肿瘤细胞表面CD40结合,可直接抑制肿瘤细胞增殖,增加抗肿瘤制剂的敏感性。更重要的是,可以增强患者抵抗肿瘤的免疫能力。本研究利用DC与CD40L在免疫反应中各自的特殊作用,构建一种经CD40L与同源肿瘤成份共同刺激致敏的DC细胞疫苗。探索其激发抗肿瘤免疫的效能及临床应用的可行性。一、材料与方法:1.构建h-CD40L表达体系(1)运用细胞分离与培养技术,由人血中分离T淋巴细胞,激活后,提取T细胞总RNA。(2)以RT-PCR方法,逆转、扩增CD40L基因片段。(3)纯化CD40L基因片段与pMD-18-T载体连接,构成CD40L重组克隆载体,转化于DH5α感受态菌,经氨苄、蓝、白斑筛选,菌液质粒的PCR及DNA测序,鉴定重组克隆载体。(4)用质粒提取试剂盒,由转化菌中,分别提取重组克隆载体pMD-18-T-CD40L与真核表达载体pcDNA3.1(+)质粒,经酶切、纯化、连接,得重组真核表达载体pcDNA3.1-CD40L,转化于TOP10感受态菌。再经氨苄筛选、菌液质粒的PCR、NheⅠ与KnpⅠ双酶切及DNA测序对重组真核表达载体pcDNA3.1-CD40L鉴定。2.CD40L表达载体的肿瘤细胞转染(1)解冻、复苏并培养H446细胞株,接种后,以脂质体法对该细胞行pcDNA3.1-CD40L转染。(2)以RT-PCR与流式细胞技术,对H446转染细胞的CD40LmRNA转录及PE标记抗CD40L染色后CD40L胞膜表达率检测。(3)以不同构型pcDNA3.1-CD40L重组质粒,分别对SK-hepⅠ、H446与H460三种细胞株进行转染,分析CD40L表达状况。(4)运用细胞原代培养技术,对手术切得肺癌组织,进行原代细胞培养,随即行pcDNA3.1-CD40L转染,流式细胞技术检测CD40L表达率。3.转染后,表达CD40L的肺癌细胞冲击致敏DC的体外免疫功能的测试:(1)以细胞培养技术进行DC细胞诱导及同源T细胞培养。(2)1%福尔马林处理未转染的、空载转染的以及CD40L转染后经G418筛选的H460细胞,制备特异致敏物,对诱导7天的DC冲击致敏。(3)以流式细胞技术,对未转染与重组转染组致敏DC表面分子CD83、CD86及HLA-DR(MHC-Ⅱ)的表达检测并比较。(4)以ELIAS法,对未转染、空载与重组转染各组致敏DC的IL-12分泌量检测并比较。(5)致敏DC经丝裂霉素增殖抑制处理后与同源T细胞共同培养5天,以MTT法对未转染、空载与重组转染各组T细胞增殖进行测试并比较。(6)致敏DC经丝裂霉素增殖抑制处理后与一定比例同源T细胞及亲代H640细胞共同培养72小时, MTT法对未转染、空载与重组转染组H460细胞的增殖抑制测试并比较。结果:1.由人激活T细胞所提总RNA经反转录及PCR扩增得到CD40L目的基因。2.重组的pMD-18-T-CD40L筛选后进行DNA测序,插入片段与NCBI核酸数据库收录编号为BC071754 CD40L序列中40至915碱基序列完全相符。3.pMD-18-T-CD40L与真核表达载体pcDNA3.1(+)分别酶切、重组后,所获重组表达载体pcDNA3.1-CD40L,经酶切、PCR及DNA测序鉴定,确认该载体中插入的DNA序列,与NCBI核酸数据库所收录编号为BC071754 CD40L序列中,40至915碱基序列完全相符,并且方向一致。4.pcDNA3.1-CD40L转染的H446,经PCR检测,存在CD40LmRNA转录。PE标记抗CD40L染色后流式细胞仪测试,转染细胞中有CD40L表达。提示:该重组载体能在肿瘤细胞中正常地执行CD40L转录、翻译及蛋白质合成的功能。5.不同构型pcDNA3.1-CD40L表达体系转染于不同类型的细胞,其表达有差异,H446以环型表达偏高,而SK-hepⅠ线型表达较高且有统计学意义。6.pcDNA3.1-CD40L分别转染SK-hepⅠ、H446与H460三种细胞株,CD40L表达率明显不同,其顺序H446> SK-hepⅠ> H460。7.pcDNA3.1-CD40L转染肺癌原代培养细胞,空载与转染组中均有CD40L表达,重组转染组明显高于空载组,两组差异有统计学意义。8.重组体转染H460后,经G418筛选,CD40L表达可达80%以上。9.重组转染后,表达CD40L的H460细胞经处理致敏DC,DC表面分子CD83、MHC-Ⅱ表达高于空载组并具统计学意义。CD86虽高于空载组,但尚不具统计学意义。10.上述致敏物冲击DC细胞后其LI-12的分泌量、对同源T细胞的增殖作用,CD40L重组转染组均高于未转染组与空载组并具统计学意义。并且对亲代H460的增殖有抑制作用。结论:1.人CD40L表达载体的成功构建,为以CD40L为组件抗肿瘤疫苗的临床研究奠定了基础。2.pcDNA3.1(+)-CD40L表达载体,以脂质法进行肿瘤细胞转染时,载体的构型不同、转染的细胞不同,CD40L的表达率也明显不同,除了脂质体与重组载体配比,它与载体的构型及细胞生理状态密切关系。3.人CD40L在原代肺癌细胞中能够进行有效表达。4.重组转染后,表达CD40L的肺癌细胞制备物致敏的DC疫苗,有较强的激发抗肿瘤特异免疫反应的能力,具有临床应用的可行性。