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背景急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是一种全球范围内的急性缺血性心脏病,其发病因素主要是在动脉粥样硬化的基础上,堵塞冠脉血液循环,引起局部心肌缺血,造成心肌细胞的大量死亡。临床上对AMI的治疗主要是采用溶栓药物或者直接进行冠脉腔内手术。但是,治疗AMI之后,通常会不可避免的发生心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/RI),进而引起心肌细胞大量死亡。有研究表明,在I/R中,心肌微血管内皮细胞(myocardial microvascular endothelial cell,CMEC)最先受到影响,发生功能紊乱。内皮细胞具有很强的分泌功能,可以通过分泌多种生物活性物质调节体内的稳态平衡,在维持正常心功能以及损伤后的修复方面具有重要的作用。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是TNF家族II型跨膜蛋白的一种,参与调节细胞凋亡、炎症反应及免疫应答。近年来,人们对于TRAIL的关注不再仅仅是其高效的凋亡作用,更多的是其在细胞内发挥的复杂生理功能上。大量研究表明,TRAIL在血管病理生理调节中有显著影响,存在潜在的心血管保护作用。研究证实,TRAIL对心血管的保护作用机制可能是通过激活磷脂酰肌醇-2激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(PI3K/Akt/eNOS)通路来实现的。eNOS能够调节内皮细胞NO的释放,而NO具有很强的舒血管功能,能够抑制血管平滑肌的增殖,起到血管内皮细胞保护作用。在AMI早期,血清中TRAIL浓度明显降低,其含量与心梗的严重程度呈负相关。体内外的研究结果证明,TRAIL对心血管疾病具有潜在的血管保护作用,在心肌梗死过程中,微血管内皮功能障碍是导致心肌缺血再灌注损伤的主要因素之一。其中AMI患者血清TRAIL浓度的降低是否是对血管内皮细胞的一种保护作用目前尚不清楚。因此,本课题主要是通过研究TRAIL在缺氧-复氧条件下对心肌微血管内皮细胞功能的影响,为心血管疾病的治疗提供新的作用靶点。目的本课题主要是从以下几个方面进行:(1)建立成年大鼠CMEC的分离及培养方法,并对CMEC进行内皮细胞特异性表面抗原鉴定;(2)研究TRAIL在常氧和缺氧-复氧条件下对CMEC的作用;(3)探讨TRAIL对CMEC作用的可能机制。方法(1)采用酶消化法分离培养Wistar雄性成年大鼠心肌微血管内皮细胞,鉴定CMEC表面标志物第VIII因子相关抗原和CD31;检测细胞增殖曲线和血管形成能力及DR5蛋白的表达。(2)常氧培养条件下,TRAIL浓度设定为0、25、50、100ng/ml,利用LDH和MTS检测TRAIL对CMEC增殖活力的影响,运用Transwell和划痕实验检测TRAIL对CMEC迁移能力的改变。(3)利用低氧工作站建立CMEC的缺氧-复氧模型。LDH和MTS检测H/R对CMEC的作用,以及缺氧-复氧后添加不同浓度TRAIL对CMEC增殖活力的影响;(4)检测TRAIL对H/R作用后CMEC迁移能力和血管形成能力的影响。实验分组为正常组(Normal)、单纯缺氧-复氧组(H/R)、TRAIL处理组(25,50,100ng/ml),利用Transwell小室和划痕实验检测CMEC迁移能力的改变,RT-PCR检测CMEC的黏附分子ICAM-1和VCAM-1的mRNA表达情况;利用Matrigel基质胶检测CEMC血管形成能力的变化,RT-PCR检测CMEC细胞内VEGF和Ang-1的mRNA表达情况;(5)RT-PCR检测TRAIL对H/R作用后CMEC炎症因子IL-1β和IL-6以及eNOS的mRNA表达影响。结果(1)采用酶消化法培养所得的微血管内皮细胞,培养至90%汇合时,细胞呈梭形或多角形,形态上呈典型的“铺路石”样生长。第VIII因子相关抗原和CD31的免疫荧光结果表达为阳性。由细胞增殖曲线结果可知,前4天,细胞呈对数生长,增殖迅速,4天之后细胞进入稳定生长状态,第7天细胞数目开始减少;Matrigel检测结果显示,CMEC血管形成能力良好,管腔结构完整;免疫荧光和WB结果表明,CMEC表面有DR5蛋白表达。(2)在常氧培养条件下,CMEC细胞中加入不同浓度TRAIL处理24h后,Transwell和划痕结果显示,50ng/ml浓度的TRAIL作用后,CMEC细胞穿过小室数目最多,划痕愈合速率最大,表明TRAIL在50ng/ml时对细胞的迁移能力影响最大;(3)CMEC缺氧-复氧模型建立。MTS和LDH检测结果显示,CMEC在缺氧4h复氧2h时,对CMEC的损伤显著,随着复氧时间的增加,细胞活力逐渐增强。Transwell和划痕实验结果可知,在H/R条件下,随着TRAIL浓度的升高,对CMEC的迁移影响逐渐增加,在50ng/ml时达到最大,100ng/ml时减弱;RT-PCR检测黏附分子ICAM-1和VCAM-1得到相似的结果;(4)在对CMEC血管形成能力的检测中,TRAIL能够促进H/R诱导的CMEC血管形成;同时增加CMEC细胞内促血管生成素Ang-1的表达,进而控制血管的成熟;对炎症因子的检测中显示,TRAIL能够抑制H/R诱导的CMEC炎症因子IL-1β和IL-6的合成,减少细胞的炎症反应,同时促进细胞eNOS的合成,提高细胞活力。结论采用酶消化法成功分离成年大鼠心肌微血管内皮细胞并鉴定成功;TRAIL在常氧和H/R条件下能够促进CMEC的迁移与增殖,其机制可能是通过促进eNOS的合成以及抑制炎症因子IL-1β、IL-6的表达来发挥内皮细胞保护作用。