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奶牛乳腺炎是乳腺组织因病原微生物的感染而引起的炎症,可导致奶牛生产性能低下,奶的产量和品质下降。严重者可造成患病乳区泌乳功能永久性丧失。在引发奶牛乳腺炎的病原菌中金黄色葡萄球菌的作用尤为突出,在某些地区大约50%以上的乳腺炎是由该菌引发。自发现金黄色葡萄球菌表面的黏附蛋白与其致病力密切相关后,黏附蛋白的相关研究一直是国内外研究的热点。同时鉴于白细胞介素18(Interleukin-18,IL-18)具有多种生物学活性,在免疫调节、抗感染及慢性炎症性疾病发病过程中起着重要作用。所以我们针对金葡菌黏附素和牛白介素18展开了研究。试验1金黄色葡萄球菌ClfA功能基因的克隆表达采用PCR方法对金黄色葡萄球菌山东分离株ZFB1的聚集因子A(ClfA)基因进行扩增,并将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中获得重组克隆pGEX/ClfA,使ClfA与GST进行融合表达。在SDS-PAGE和Western blot试验中,表达产物分子量(约67KDa)同预期结果相符,与兔源抗ZFB1全价血清有特异的抗体结合活性。本研究表明:金葡菌ZFB1的ClfA基因与已发表的NEWMAN株(NCBI ACCESSION NUMBER:AP009351)序列在核苷酸水平的同源性均为99.9%,氨基酸水平的同源性为100%,两者的差异仅是由于在41位发生T变为C的无义突变;在大肠杆菌中ClfA蛋白表达量可达菌体总蛋白的24.2%,从而为奶牛金黄色葡萄球菌性乳腺炎的防治提供了科学的实验依据。试验2金黄色葡萄球菌聚集因子ClfA蛋白抗血清活性分析按照实验1中最佳诱导条件诱导ClfA蛋白表达,而后进行SDS-PAGE,将其冻干并碾成粉末。用PBS与碾碎的粉末等体积混合后,取0.2ml(约20μg抗原),腹腔和背部皮下注射健康的五周龄小鼠,每隔两周加强免疫共五次,末次免疫后第10天断尾采血制备血清,而后采用黏附与黏附抑制试验模拟金黄色葡萄球菌定植奶牛乳腺组织的致病过程,以ClfA/GST抗血清的黏附抑制率表示其活性。结果显示:2%、1%、0.5%和0.2%的阳性血清其抑制率分别为65%、60%、46%和41%,与阴性血清相比差异极显著(P<0.001)。随着血清浓度的下降黏附抑制作用也减弱,当阳性血清浓度为0.1%时,黏附抑制作用则很不明显,仅为3%,与阴性血清相比差异不显著(P=0.35)。本研究结果证实ClfA可以作为保护性抗原基因,为研制有效的金黄色葡萄球菌性乳腺炎疫苗奠定了基础。试验3金黄色葡萄球菌ClfA功能基因的克隆表达与牛IL-18基因真核共表达载体的构建与表达本研究旨在构建金黄色葡萄球菌聚集因子A基因和牛IL-18基因共表达的真核载体,并对其表达产物进行鉴定检测。参照聚集因子A(ClfA)和牛白介素18(BoIL-18)cDNA序列分别设计引物进行扩增,将ClfA基因和BoIL-18基因分别插入到真核双表达载体pBUDCE4.1的CMV和EF-1α两个启动子的下游,构建携带两个目的基因的重组真核双表达载体pBUDCE/ClfA/BoIL-18。在Cellfectin Reagent的作用下转染293T细胞,用间接免疫荧光试验检测ClfA和BoIL-18蛋白,结果证明重组质粒pBUDCE/ClfA/BoIL-18在293T细胞中同时表达了ClfA和BoIL-18蛋白。该重组载体的成功构建为研究ClfA和BoIL-18重组共表达产物的生物学活性及其防治奶牛金黄色葡萄球菌性乳腺炎的作用奠定基础。试验4金黄色葡萄球菌FnbpA功能基因的克隆表达与牛IL-18基因真核共表达载体的构建与表达本研究旨在构建金黄色葡萄球菌FnbpA基因和牛IL-18基因共表达的真核载体,并对其表达产物进行鉴定检测。参照FnbpA和牛白介素18(BoIL-18)cDNA序列分别设计引物进行扩增,将FnbpA基因和BoIL-18基因分别插入到真核双表达载体pBUDCE4.1的CMV和EF-1α两个启动子的下游,构建携带两个目的基因的重组真核双表达载体pBUDCE/FnbpA/BoIL-18。在Cellfectin Reagent的作用下转染293T细胞,用间接免疫荧光试验检测FnbpA和BoIl-18蛋白,结果证明重组质粒pBUDCE/FnbpA/BoIL-18在293T细胞中同时表达了FnbpA和BoIL-18蛋白。该重组载体的成功构建为研究FnbpA和BoIL-18重组共表达产物的生物学活性及其防治奶牛金黄色葡萄球菌性乳腺炎的作用奠定基础。