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前期从传统中药南柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd)茎尖诱导的细胞株中筛选得到一株高抗紫外线的柴胡细胞克隆,命名为“Anti－UV Clone”。本文检测了该细胞株和对照生药南柴胡茎叶的多糖、皂甙、黄酮、总三萜的含量,利用溶剂相似相溶原理提取得到不同极性溶剂的提取物。运用DPPH法检测提取物的自由基清除能力。着重研究中波紫外线(UVB)照射所致人角质形成细胞HaCaT的氧化损伤和“Anti—UV Clone”(以柴胡生药为对照)各提取物对HaCaT细胞氧化损伤过程中的防护作用。
获得如下主要结果:
1.“Anti-UV Clone”柴胡细胞株多糖含量较柴胡生药高约3倍,占细胞干重的2.5％。同时三萜的含量也达到了2.5％,而相对的外植体只有1.5％。细胞克隆皂苷和黄酮的含量则比植物材料少。
2.以不同溶剂的提取得到9种溶剂粗提物。DPPH实验结果所示,各提取物清除自由基的能力呈剂量依赖性。细胞粗多糖的清除自由基能力最强达到78.79％,其次是生药脂溶性提取物。
3.在提取物对UVB诱导的HaCaT细胞凋亡影响研究中,用噻唑蓝法(MTT法)检测各粗提取物对细胞生长状态和提取物对UVB照射的HaCaT细胞活性的影响。研究表明:“Anti-UV Clone”柴胡细胞株水直接提取物,75％乙醇直接提取物,正丁醇提取物,剩余物质及粗多糖对HaCaT细胞的活性没有负面影响,其中添加细胞粗多糖提取物的,细胞活性可比空白对照高出24.52％。UVB照射后再加入各提取物,能提高细胞活性,在10mg／ml范围内存在剂量依赖性,其中加入10mg／ml细胞粗多糖能获得70.92％的防护作用。同时发现“Anti-UVClone”柴胡细胞株中的主要活性成分则溶于水,而柴胡生药中的主要活性成分溶于有机溶剂。
4.检测细胞培养液的超氧化歧化酶(SOD)和细胞内的活性氧簇(ROS)含量表明:柴胡生药和细胞提取物普遍具有提高SOD酶活性的功能,在照射紫外线后加入粗多糖可检测到显著的SOD酶活的提高,表明提取物可以提升细胞体内抗氧化的防御作用。同时提取物对防止ROS过量积累也有一定积极作用,其中细胞克隆水直接提取物和75％7,醇剩余提取物及粗多糖效果最为显著。
5.UV照射角质形成细胞中的氧自由基含量提高,引起DNA中AP位点增加,从而诱导细胞凋亡。加入细胞株粗多糖后,AP位点恢复接近正常水平,粗多糖可以显著抑制UVB照射后引发的脱碱基位点的产生,而生药的各处理组和细胞的非极性溶剂提取物各处理组对于减少AP位点作用较弱。
以柴胡生药为对照,“Anti-UV Clone”柴胡细胞株多糖含量高,细胞粗多糖、水直接提取物和75％7,醇剩余物具有增强HaCaT细胞活性、清除细胞氧自由基,及抑制紫外线对DNA的损伤进程的作用,进而抑制了紫外线诱导的细胞凋亡的发生。对HaCaT细胞的UVB损伤具有明显保护作用。细胞粗多糖、水直接提取物和75％7,醇剩余物都含有水溶性多糖,可能是多糖在“Anti-UV Clone”柴胡细胞株里具有强抗紫外线辐射中扮演重要角色。积极推动该细胞的工程化应用,特别是在化妆品或皮肤用药方面的应用具有重要的实际意义。