论文部分内容阅读
研究背景血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)家族已经被发现的成员包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和PlGF(placenta growth factor,胎盘生长因子),是目前研究较为深入的血管生长因子家族。其中最主要的成员是VEGF-A,又称VEGF、1-3在人类,主要包括几种分子量不同的同种异构体,如：VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206等1,其中VEGF165效应性最强4。血管内皮细胞特异性的VEGF受体(VEGF receptor, VEGFR)介导VEGF家族成员对内皮细胞增殖、微血管增生及增强血管通透性等的作用3一,其可分为两大类：酪氨酸激酶受体(VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3),与非酪氨酸激酶受体(neuropilin-1(NRP-1), neuropilin-2(NRP-2)。对内皮细胞的增殖、分化作用主要由VEGFR-2介导的6.7。近年来发现VEGFR-2除了表达在血管内皮细胞外,而且还表达在一些非血管内皮细胞上,如黑素细胞11、视网膜上皮细胞10、造血干细胞、神经元细胞、血管平滑肌细胞9以及某些肿瘤细胞8。而且在正常人的皮肤角质形成细胞、毛囊上皮细胞(包括毛囊隆突部细胞)、汗腺及皮脂腺细胞均发现VEGFR-2的表达。因此证实VEGF-2在毛囊上皮细胞中表达的生物学意义有助于解决毛囊生物学中的一些问题。目的明确VEGFR-2在毛囊上皮细胞中的表达情况,及与毛发周期的相关性。研究毛乳头细胞分泌的VEGF除以旁分泌的形式发挥血管形成作用之外,是否还可以通过VEGFR-2直接作用于毛囊上皮细胞产生生理调节作用。重点研究VEGFR-2在毛囊隆突部细胞中的表达、VEGF对其表达的影响以及通过VEGFR-2介导的毛囊隆突部细胞的增殖、迁移和黏附,以及VEGFR-2下游信号表达的影响。方法第一部分：用免疫荧光法检测VEGFR-2在小鼠不同毛发周期中的表达情况。利用免疫荧光双染技术,探讨了在人头皮毛囊中VEGFR-2与增殖、分化、凋亡指标的免疫荧光共染情况。第二部分：用VEGFR-2的中和性抗体MAB3572预处理,同时使用外源性VEGF165作为刺激因子刺激体外培养的人毛囊隆突部细胞,提取总RNA和蛋白质,以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测毛囊隆突部细胞VEGFR-2mRNA的表达水平；以Western-blot法检测培养的隆突处细胞VEGFR-2蛋白质的表达水平,观察对角蛋白K10、K14、K16、K19以及β-catenin、integrinβ1、Lgr6、Artemis (Serine516)表达的影响。分别用MTT法、Trans well法观察不同浓度VEGF165作用下体外培养的经MAB3572预处理或未预处理的隆突部细胞增殖、粘附和迁移能力的变化。以25ng/ml VEGF165刺激MAB3572预处理或未预处理的隆突部细胞,以Western-blot法检测观察其对VEGFR-2、P38、C-Jun、ERK1/2磷酸化的影响,探讨VEGFR-2介导的调节细胞活性的细胞内信号传导途径。第三部分：提取总RNA,以逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcriptpolymerase chain reaction, RT-PCR)检测人毛囊Artemis mRNA的表达水平,用免疫荧光法检测Artemis (Serine516)在人头皮毛囊、皮脂腺、汗腺等处的表达,以及在小鼠不同毛发周期毛囊中的表达情况。利用免疫荧光双染技术,探讨了毛囊隆突部细胞Artemis (serine516)与增殖、分化、凋亡指标的免疫荧光共染情况。结果一、免疫组化发现人头皮毛囊表达VEGFR-2及磷酸化VEGFR-2,小鼠毛囊上VEGFR-2表达随毛发周期发生改变。二、VEGFR-2与K16、K14、p-P53、Bax、bcl-2、β-catenin、integrinβ1等荧光双染重叠良好。在髓质、皮质区域与K10、involucrin等荧光双染重叠良好。三、VEGFR-2培养的隆突部细胞的表达：1) RT-PCR:体外培养的隆突部细胞表达VEGFR-2mRNA, VEGF165促进体外培养的隆突部细胞表达VEGFR-2mRNA, VEGFR-2中和性抗体MAB3572能够拮抗VEGF165对体外培养的隆突部细胞表达VEGFR-2mRNA表达的上调。2) Western-blot:体外培养的隆突部细胞在蛋白质水平表达VEGFR-2。VEGF162促进体外培养的隆突部细胞表达VEGFR-2, VEGFR-2中和性抗体MAB3572能够拮抗VEGF165对体外培养的隆突部细胞表达VEGFR-2表达的上调。四、VEGF165促进体外培养的隆突部细胞的增殖、异质性粘附、迁移能力,抑制同质性粘附能力。五、VEGFR-2中和性抗体MAB3572能够拮抗VEGF165对体外培养的隆突部细胞增殖、异质性粘附、迁移能力的促进及同质性粘附能力抑制。六、VEGFR-2中和性抗体MAB3572能够拮抗VEGF165对体外培养的隆突部细胞促进表达整合素β1及Artemis (Serine516),抑制表达Lgr6。七、VEGFR-2中和性抗体MAB3572能够拮抗VEGF165对体外培养的隆突部细胞表达K16、K19、K14等的促进作用。八、VEGFR-2中和性抗体MAB3572能够拮抗VEGF165对体外培养的隆突部细胞表达K10的抑制作用。九、VEGF165促进体外培养的隆突部细胞VEGFR-2、c-Jun、ERK1/2、p38的磷酸化及P-catenin向细胞核内转位,VEGFR-2中和性抗体MAB3572能够拮抗VEGF165对隆突部细胞VEGFR-2、c-Jun、ERK1/2、p38的磷酸化作用及β-catenin向细胞核内转位。十、VEGF165促进体外培养的隆突部细胞Artemis在serine516位点的磷酸化,VEGFR-2中和性抗体MAB3572能够拮抗VEGF165对隆突部细胞Artemis在serine516位点的磷酸化。十一Artemis (serine516)的表达方式随毛发周期改变。在人头皮生长期毛囊中的上半部分上皮细胞与表皮强阳性表达Artemis (serine516),在汗腺及皮脂腺也可见Artemis (serine516)表达。十二、Artemis (serine516)与K16荧光双染重叠良好,但是与K10、p-P53、 Bax、bcl-2、K14、Ki67等信号表达趋势相反；与c-myc、p21表达位置紧邻,信号表达趋势相一致。结论一、毛囊上皮包括隆突部细胞在mRNA和蛋白质水平上均表达VEGFR-2.二、VEGFR-2参与介导毛囊隆突部细胞的增殖、迁移、粘附、分化。三、VEGFR-2参与毛囊的生长、分化过程及毛发周期调控；VEGFR-2对毛囊的调控可能与β-catenin相关。四、VEGFR-2发挥生物学效应部分通过Artemis的磷酸化,发挥对毛囊生物学活性的调节作用。