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氯霉素(Chloramphenicol,CAP)是应用广泛的抗生素,但由于氯霉素存在严重的副作用威胁着人类的健康,所以必须对畜产品和食品中CAP残留进行严格检测和控制。而酶联免疫吸附测定法(ELISA)具有灵敏度高、特异性强、仪器设备要求低和样品前处理相对简单等优点,适于现场监控和大量样品筛查,也可以直接应用于生产实践,所以这种方法越来越多地应用于食品中有毒物质的快速检测。 为了建立氯霉素检测的酶联免疫吸附分析方法,首先必须制备出效价高特异性强的抗体。为此,必须将不具有免疫原性的氯霉素分子共价连接到生物大分子上形成具有免疫原性的全抗原。本文分别采用戊二醛(GA)和N,N’-羰基二咪唑(CDI)活化法将氯霉素连接到牛血清白蛋白(BSA)上,合成了氯霉素免疫抗原和包被抗原。反应后的产物经过透析或超滤,用Superdex 75纯化,收集对应峰。合成的氯霉素的全抗原紫外扫描和红外光谱检测表明氯霉素与BSA偶联成功。用TNBS法测氨基酸残基,得到BSA上偶联的氯霉素数目:戊二醛合成的抗原偶联数较大,而羰基二咪唑活化合成的抗原偶联数相对适中,大多在10～20之间。所合成的抗原采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)只见一条区带,表明所合成的氯霉素与BSA偶联物可以做为免疫抗原。用所买的氯霉素快速检测试剂盒可以定性定量测定所合成抗原中氯霉素的含量。 鉴于以上结果可以把所合成的氯霉素与BSA的偶联物作为免疫抗原注射到母鸡体内得到氯霉素卵黄抗体(IgY)。加强免疫后抗体的特异性活性在十个月后保持不变;卵黄液采用不同的初步提纯方法纯化,发现选用经过优化条件的辛酸-硫酸胺沉淀法初步提取卵黄抗体,得到IgY纯度最高,蛋白含量也较高,卵磷脂去除较彻底,有利于长期保存。 选用3,3’-二氨丙基亚胺(DADPA)作为亲和凝胶与配基氯霉素之间的“间隔臂”,合成了分离纯化抗氯霉素特异性IgY的免疫亲和层析柱。初步提取后的IgY经过免疫亲和层析柱,特异性的IgY抗体所占的总IgY比例达到3.3%左右,抗体活性提高10倍。