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体外循环（cardiopulmonary bypass,CPB）是心内直视手术的一种重要手段,随着CPB技术、心肌保护措施和心脏外科手术技巧不断完善与提高,心内直视手术的并发症发生率和病死率逐步下降。然而,肺损伤仍是CPB术后的主要并发症之一。Nature杂志于21世纪初首次提到以迷走神经及其主要递质乙酞胆碱（Ach）构成的神经-免疫调节通路,即-胆碱能抗炎通路（Cholinergic Anti-infammatory Pathway CAP）。CAP是一种内源性的神经反馈调节通路,当机体受到损害性刺激而引发炎症反应时,迷走神经释放Ach至外周组织,Ach与巨噬细胞或其他免疫细胞表面相应受体相结合,通过调节机体内部一系列病理生理反应,而发挥抗炎作用。在此过程中,Ach主要作用于烟碱型乙酞胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptor,nAChR）和毒覃碱型乙酞胆碱受体（muscarinicacetylcho-linereceptor,m AChR）,两者主要分布于迷走神经效应细胞表面,分别受配体门控离子通道受体家族和G-蛋白藕联受体家族的调控。κ-阿片受体（kappa opioid receptor,KOR）由380个氨基酸组成,是阿片类受体的一类亚型,属于G蛋白偶联受体家族,主要分布于中枢神经组织,经原位杂交法检测发现在大鼠海马齿状回、下丘脑、某些丘脑核团以及大脑皮层、尾状核、嗅球、伏隔核和脊髓等部位均存在κ-阿片受体的mRNA,并且发现在肺迷走神经部位也存在κ-阿片受体。在中枢神经系统它们不仅有着良好的镇痛活性,且无呼吸抑制、成瘾性、便秘、耐受性等μ阿片受体样副作用,还能够对抗μ阿片受体激动后引起的药物依赖性。目前已证明κ-激动剂能明显改善μ-激动剂导致的记忆损害,其作用不仅与μ-受体激动剂作用相反,并且能调节μ受体的作用,如抗伤害作用,对体温的影响,对伏隔核多巴胺释放的影响以及对脊髓中甲硫脑啡肽样物质释放的影响等,但是目前对于κ-阿片受体激动剂对肺损伤的作用暂不明确。本研究除从细胞、分子和基因水平上探讨CPB对肺上皮屏障功能损伤的机制外,还将进一步探讨κ-阿片受体对CPB后肺上皮屏障保护的可行性。旨在为其临床应用提供实验依据,亦为临床减少CPB手术后急性肺损伤的发生率提供有效的防治措施。实验材料与方法实验材料1、实验动物:健康雄性SD大鼠,体重400500g。2、主要试剂及药品:TNF-α、IL-6、IL-10免疫组化试剂盒（天津九鼎医学生物工程有限公司）,水合氯醛（上海化学试剂采购供应站分装厂）;α7nAChR抗体（Santa Cruz Biotechnology）,MPO、MDA、SOD（南京建成生物工程研究所）。3、主要仪器:高速离心机（TDL-SA）;三用电热恒温水浴箱（DH）-600);多功能振荡器;倒置显微镜（OLYMPUS-Ix70 Model,Japan）;RX-2000型全自动生化分析仪（美国Technicon公司）;TKR-200C小动物呼吸机（江苏特力麻醉呼吸设备公司）;特制微型膜肺（广东科威医疗器械有限公司提供采）;小型蠕动泵（保定兰格恒流泵有限公司,BT002300M型）。实验方法1、大鼠CPB的建立取雄性SD大鼠,以10%水合氯醛350 mg·kg-1腹腔内注射麻醉,气管插管接小动物呼吸机辅助呼吸。通过微型化CPB环路设备,经右颈静脉腔房引流、左颈动脉灌注,方法建立大鼠开胸停跳CPB模型。2、实验分组SD大鼠56只随机分为SH、CPB、CPB+Ach、CPB+U50488、CPB+U50488SH+THAG2五组,CPB组24只,其余每组8只。SH组:为假手术对照组（Sham-operated group,SH）,大鼠只在相应部位插管,但不进行CPB转流。CPB组:设主动脉开放组,CPB60min结束时和停CPB后2h时三个相点。CPB+Ach、CPB+U50488、CPB+U50488SH+THAG2组:各组大鼠在手术开始之前给予相应的预处理因素。3、观察指标和检测方法（1）大鼠血管外肺水含量测定;（2）肺组织MDA、MPO和SOD浓度的变化;（3）血浆IL-6、IL-10、TNF–α、LPS和MMP-9的变化;（4）HE和透射电镜观察肺组织形态学变化;（5）肺组织α7-nAChR蛋白和mRNA的表达。实验结果一、各组大鼠肺上皮屏障功能的变化CPB组大鼠的EVLW、血浆LPS浓度及MMP9浓度均增加,差异具有统计学意义,提示CPB后,大鼠的炎症反应增加、肺上皮功能受损。二、肺组织MDA、MPO和SOD水平变化CPB组肺组织MDA、MPO浓度明显升高,SOD浓度明显降低,与SH组相比较,差异具有统计学意义（P<0.05）;而给予阿片受体激动剂U50488后,氧化应激的水平有所缓解,给予抗胆碱能通路激动剂及抑制剂后,U50488的这种作用受到增强和抑制。二、血浆TNF-a、IL-6和IL-10水平变化CPB组血浆TNF-a、IL-6浓度明显升高,IL-10浓度明显降低,与SH组相比较,差异具有统计学意义（P<0.05）;而给予阿片受体激动剂U50488后,炎症反应状态有所缓解,给予抗胆碱能通路激动剂及抑制剂后,U50488的这种作用受到增强和抑制。三、各组大鼠肺组织形态学改变1、HE染色光镜观察SH组大鼠肺组织结构完整,肺泡腔清晰,肺泡间隔无水肿,CPB2h组肺泡壁明显增厚,肺泡内充血/出血,大量炎性细胞浸润,而给予阿片受体激动剂U50488后,炎症反应状态有所缓解,给予抗胆碱能通路激动剂及抑制剂后,U50488的这种作用受到增强和抑制。2、透射电镜观察SH组肺组织超微结构基本正常,血管内皮细胞形态结构正常;CPB2h组肺组织超微结构明显受损,气血屏障结构模糊,水肿增厚,部分肺泡上皮细胞缺损,血管内皮基底膜断裂,线粒体结构破坏呈空泡状改变,板层小体排空。而给予阿片受体激动剂U50488后,炎症反应状态有所缓解,给予抗胆碱能通路激动剂及抑制剂后,U50488的这种作用受到增强和抑制。四、肺组织α7nAChR蛋白表达变化与肺上皮屏障功能的关系肺组织α7nAChR蛋白表达与大鼠的EVLW、血浆LPS浓度、MMP9浓度、MDA、MPO浓度呈负相关,与血浆SOD浓度呈正相关。五、给予α7-nAChR激动剂后,各组炎症通路的变化给予抗胆碱能通路激动剂Ach后,CPB+Ach组血浆TNF-a、IL-6水平明显低于CPB组,NF-κB的含量也明显低于CPB组,差异有统计学意义;而大鼠EVLW明显低于CPB组,差异有统计学意义。结论1、CPB后大鼠EVLW、血浆LPS、MMP-9水平明显升高,是肺上皮屏障功能受损的重要机制。2、CPB后肺上皮中a7n AchR蛋白及mRNA减少,可能是CPB引起大鼠肺上皮屏障功能障碍的机制之一。3、CPB后全身炎症反应是引起肺上皮屏障功能障碍的重要因素,并在全身性损害中起重要作用。a7nAchR与肺损伤的程度、炎症反应及NF-κB通路具有相关性,可能是a7nAchR参与调节CPB后肺损伤的机制之一。4、κ-阿片受体预处理可以减轻CPB后缺血再灌注损伤和全身炎性反应程度,降低肺泡上皮的通透性,对肺上皮屏障起到一定的保护作用,这种作用存在一定剂量的依赖性。5、κ-阿片受体预处理保护肺上皮屏障功能,可能通过激活CAP-NF-κB信号通路,启动内源性保护机制,抗氧化损伤、调节炎症反应等途径实现。