亲和细胞分离技术是一种快速、有效地从杂合的细胞悬液中分离目的细胞的方法。其主要原理是利用配体与所分离细胞表面分子特异性结合进行细胞分离。　　 通常情况下，组织或牛物样品中的细胞群都是杂合的，由不同类型的细胞混合在一起，而感兴趣的细胞往往只占其中很少的一部分。如血细胞中的干细胞，母亲血液中的胎儿细胞，处于缓解期的白血病、肿瘤患者体内残余的白血病细胞、肿瘤细胞等等。在实际工作中分离这些细胞或亚群细胞，如分离干细胞用于移植，分离胎儿细胞用于胎儿产前检查，分离残余细胞用于疾病的诊断和防止复发等等有重要的临床意义，同时在基因组和蛋白质组学研究中也具有非常重要的价值。　　 传统细胞分离方法主要根据细胞的大小、形态以及密度的不同进行分离，如采用微虑(Microfiltration)、超滤(Ultrafiltration)以及超离心(Ultracentrifugation)等方法。这些方法操作简单，但特异性差，难以适用大规模操作。有时待分离的细胞与其它混杂的细胞形态、大小等差异不明显，采用这些方法难以分离。其次是采用荧光标记探针的流式细胞技术进行目的细胞筛选具有高度的准确性，但是这种方法费时、费用高等不足之处难以普遍应用。或者应用磁珠分离技术进行细胞分离在细胞生物学和医学微生物学中的应用受到广泛关注，但是该方法主要局限在分析水平层次上，而且存在非特异性吸附现象。　　 目前应用最广泛的细胞分离技术之一就是利用单克隆抗体特异性结合细胞表面抗原的亲和细胞分离技术。在亲和细胞分离技术中，亲和层析技术由于费用低廉，操作简便，逐渐成为大家的首选。　　 本试验的目的就是建立一种以Sephadex为载体，SpA为配体的亲和细胞分离技术，并应用于输血医学。首先，利用构建的载体建立一种微柱亲和层析细胞分离技术，分离结合和未结合抗体的红细胞，以检测红细胞抗原抗体反应:第二，利用构建的载体建立一种玫瑰花结亲和细胞分离技术，分离致敏和非致敏红细胞。　　 第一章构建Sephadex-Gly-NHS-SpA和Sephadex-Gly-SpA载体。　　 背景:亲和细胞分离技术首先要选择好合适的载体和配体，才能有效地分离目的细胞。Sephadex是一种被广泛应用的细胞分离载体之一，具有很好的稳定性；分子内含有大量的活性基团，有利于偶联其它化合物；低排阻限(Lowexclusion limit)，大分子量配体难以进入其内部，使配体主要与载体表面的活性基团结合。SpA是一种非常稳定的膜表面受体蛋白，可以与不同来源、不同类型的免疫球蛋白(Ig)Fc段结合，而且结合非常稳定。　　 本试验中，分离的是相对比较大的红细胞，主要与分离载体表面的配体结合；同时红细胞表面的抗体为不同来源的免疫球蛋白，因此选择Sephadex作为载体，SpA作为配体。亲和细胞分离技术的分离效果与许多因素有关，研究表明使用间隔臂能够减少配体之间的空间阻碍，提高分离效果。所以本试验选用NHS为间隔臂，比较使用间隔臂与否对结合抗体的影响。　　 方法:首先比较在不同溶剂中Sephadex的膨胀程度和CDI活化效率，然后选用两种溶剂，同时采用直接法和间接法--通过NHS间隔臂构建偶联SpA的载体。比较通过不同方法偶联SpA至载体的效率是否有差异，并进一步检测构建的载体结合IgG免疫球蛋白是否有区别。　　 结果:Sephadex在水、DMF、丙酮等三种不同的溶剂中，在DMF中膨胀程度最大，CDI活化后氨基酸残基浓度最高；在丙酮中膨胀最小，活化的氨基酸残基浓度最低。采用NHS间接法偶联SpA的量和效率稍高于直接法，在DMF溶剂中，直接偶联SpA的效率最高为93％，采用NHS间隔臂最高为95％；在丙酮溶剂中，直接偶联SpA的效率为77％，采用NHS间隔臂为88.5％。构建好的Sephadex-Gly-NHS-SpA和Sephadex-Giy-SpA两种载体与抗体的结合量，含有间隔臂的高于没有间隔臂，但是含有间隔臂的载体结合抗体的速度慢于没有间隔臂的载体。在DMF溶剂中构建的载体结合抗体的量高于在丙酮溶剂中构建的载体。　　 结论:采用膨胀程度高的溶剂有助于活化更多的活性基团，使用间隔臂能够减少配体之间的空间阻碍效应，提高其与免疫球蛋白的结合。因此本试验后面应用研究选用DMF作为有机溶剂，偶联配体通过NHS间隔臂。　　 第二章建立微柱亲和层析细胞分离技术--分离结合与未结合抗体的红细胞，以检测红细胞抗原抗体反应　　 背景:在输血医学中，最有临床意义的抗体包括，IgM和IgG型两大类，输血前检查必须能够检测出这两种类型的抗体才能保障输血安全。采用安全可靠的输血前检查方法对保障输血安全具有非常重要的意义。目前输血前检查的方法主要有盐水法、凝聚胺法、经典的抗球蛋白法、微柱凝胶技术、固相法、亲和柱技术等。盐水法只能检测IgM型抗体，其它几种方法可以检测IgG型的抗体。经典的抗球蛋白法是金标准，但是操作时间长、步骤繁琐、结果不稳定以及人为主观因素强等缺点；微柱凝胶技术和亲和柱技术是新开发的一项技术，他们都具有加样小、操作简便、省却细胞洗涤和结果可靠等优点，应用越来越广泛。在国外已经替代凝聚胺法，成为输血前检查主要方法。但是亲和柱技术对IgM型抗体及补体引起的致敏红细胞检出能力有限。在我国应用最广泛的方法是凝聚胺法。研究报道凝聚胺法对ABO血型系统及抗-K等抗体检出能力有限。本实验采用构建的载体建立一种微柱亲和层析技术分离结合和未结合抗体的红细胞，以检测红细胞抗原抗体反应。　　 方法:采用凝聚胺法、本试验建立的微柱亲和层析技术及其它经典的方法同时检测了80例弱抗原抗体反应、10例抗-Jka/Jkb血清以及40例献血者的Kidd血型，对目前我国最广泛应用的凝聚胺法及本试验设计的微柱亲和层析技术进行性能评价:同时采用本研究设计的微柱亲和层析技术与微柱凝胶技术分析10例血清的滴度，比较两者的结果。　　 结果:凝聚胺试剂对弱IgM型的抗原抗体阳性检出率为56.25％，而盐水试管法为87.5％，两种方法比较具有统计学差异，说明凝聚胺试剂检出弱lgM型的抗原抗体反应能力没有盐水试管法灵敏:10例抗-Jka/Jkb血清，凝聚胺漏检了4例。40例献血者Kidd血型定型结果，凝集胺漏检了4例Jk(a+b-)，15例Jk(a+b+)，2例Jk(a-b+)。说明凝聚胺对Kidd血型系统的抗原抗体反应检测能力有限。　　 采用本试验建立的微柱亲和层析技术，检测80例弱IgM型抗原抗体反应，阳性结果为86.25％，与盐水试管法没有统计学差异；检测10例抗-Jka/Jkb血清和40例献血者Kidd血型，结果与经典的抗球蛋白法结果完全一致。采用亲和微柱方法进行抗体滴度分析结果显示，该方法与微柱凝胶技术比较，检测IgG类抗体的灵敏度和特异性优于微柱凝胶技术，同时能够检测IgM型抗体，没有出现非特异性吸附现象。　　 结论:使用凝聚胺技术进行输血前检查时，不能有效地保证输血安全，该技术不适合应用于临床输血前检查，只能作为一种替补方法，或者用于紧急情况。　　 本试验建立的以微柱代替传统的层析柱，采用离心使细胞分离的微柱亲和层析融合了微柱凝胶技术和亲和柱技术，克服了亲和柱技术对IgM抗体漏检问题，与盐水法、经典的抗球蛋白以及微柱凝胶技术进行比较，结果说明本试验设计的微柱亲和层析技术具有良好的检测红细胞抗原抗体反应性能。　　 第三章建立玫瑰花结亲和细胞分离技术--分离致敏与非致敏红细胞　　 背景:在输血医学中，一些疾病，如自身免疫性溶血性贫血、新生儿溶血病、溶血性输血反应和药物诱导的溶血等，这些患者红细胞表面已经致敏了抗体。由于红细胞已经与抗体结合，会干扰包括血型鉴定和交叉配血等试验结果。目前的方法是将结合到患者红细胞上的抗体与红细胞分离，然后采用没有致敏的红细胞进一步检测。但目前所采用的方法都有不同程度的缺陷，本试验的从另一个角度出发，采用构建的Sephadex载体将致敏与非致敏红细胞分离出来，然后利用非致敏红细胞进一步检测。　　 方法:首先检测载体Sephadex-Gly-NHS-SpA和Sephadex-Gly-SpA结合致敏红细胞能力。再进一步进行患者标本检测，共检测了5例自身免疫性溶血性贫血标本，观察其分离效果。　　 结果:含有间隔臂的载体结合红细胞量为5.02×108/mL Sephadex，明显高于没有间隔臂的载体2.52×106/mL Sephadex。而且使用间隔臂构建的载体结合致敏红细胞紧密，没有采用间隔臂的载体结合疏松，很容易从载体上脱落。检测5例自身免疫性溶血性贫血患者标本，成功分离了3例，另外2例由于非致敏红细胞比例太少，分离效果不理想。　　 结论:使用间隔臂偶联配体能够明显提高载体结合红细胞的量，同时没有见隔壁的载体会阻碍配体与红细胞结合，减弱红细胞与载体结合的力度。构建的载体能够有效地分离致敏和非致敏红细胞。应用于临床标本检测，主要与患者体内致敏红细胞的比例密切相关。如果患者非致敏红细胞比例太低。DAT检测结果4+的患者，分离效果不好。对于DAT检测结果为3+或以下的患者，可以成功分离。该方法的建立，为自身免疫性溶血性贫血患者血型鉴定和交叉配血困难提供了另一种思路和方法。